一、仪器概述

QuantStudio 5属于Thermo Fisher QuantStudio系列的中高端机型，提供96孔标准板和Fast 96孔两种模块规格。仪器采用创新的光学系统设计，实现多通道同时检测和快速荧光采集，支持多种荧光染料（FAM、VIC、ROX、SYBR Green、CY5等）。
主要技术特点如下：

1. 温控精度高：采用先进的Peltier半导体加热制冷技术，孔间温差控制在±0.25℃以内。

2. 光学检测稳定：LED光源与CCD成像系统配合，支持多通道检测与光谱解卷积算法。

3. 软件智能化：内置Design & Analysis软件，提供扩增曲线分析、熔解曲线分析、Ct值计算和标准曲线生成。

4. 网络化操作：可通过Thermo Fisher Connect云平台实现远程实验设计与数据管理。

5. 通量与速度兼顾：支持常规PCR程序与快速PCR程序模式。

二、工作原理

QuantStudio 5的检测原理基于荧光信号实时采集。PCR扩增过程中，每个循环的DNA产量成倍增加，系统通过荧光染料或特异性探针的信号变化反映扩增进程。

1. 在退火或延伸阶段，荧光染料（如SYBR Green）与双链DNA结合发光，或TaqMan探针被DNA聚合酶切割释放Reporter荧光基团；

2. 光学模块激发样品中的荧光分子，CCD相机采集发射信号；

3. 软件实时绘制荧光强度与循环数的关系曲线，形成扩增图；

4. 系统自动计算Ct值，生成定量结果。

这一原理实现了核酸扩增与检测同步进行，使定量PCR反应具有实时性、灵敏性和高准确性。

三、仪器组成与结构

1. 主机部分

• 热循环模块（Thermal Cycler Block）：用于样品加热和冷却；

• 光学检测模块（Optical System）：包括LED激发光源、滤光片组与CCD检测器；

• 触摸屏控制面板：用于设置实验参数与监控进度；

• 通风冷却系统：保持内部温度稳定；

• 数据通信接口：支持USB和以太网连接。

2. 配套组件

• 96孔PCR反应板或8联管；

• 光学透明密封膜；

• 校准板与标准品试剂。

3. 软件平台

• QuantStudio Design & Analysis软件（本地版）；

• Thermo Fisher Connect云端平台（在线版）。

四、使用前准备

1. 环境要求

• 室温控制在18–25℃，湿度30%–80%；

• 避免强光、震动与电磁干扰；

• 保持实验台面干燥清洁。

2. 电源检查

• 电压稳定在220V ±10%，接地良好；

• 建议使用稳压电源和UPS设备。

3. 系统开机

• 打开主机电源开关，系统自动自检；

• 确认显示屏运行正常。

4. 试剂准备

• 配制PCR反应体系（Master Mix、引物、模板、探针等）；

• 避免气泡产生，可短暂离心。

5. 反应板加载

• 将样品加入反应孔（20 μL或25 μL体系）；

• 贴膜封口，确保无气泡和液体外溢；

• 放入仪器样品仓并关闭盖板。

五、实验设置步骤

1. 新建实验项目
   在软件中选择“New Experiment”，输入实验名称、描述与存储路径。

2. 选择实验类型

• Relative Quantification（相对定量）；

• Absolute Quantification（绝对定量）；

• Melt Curve（熔解曲线分析）；

• Genotyping（SNP分型）；

• Presence/Absence（病原体检测）。

3. 配置反应体系

• 选择荧光模式（SYBR或TaqMan）；

• 设置荧光通道，如FAM、VIC、ROX、CY5；

• 输入样品名称、靶标名称与任务类型（Unknown、Standard、Control）。

4. 设定扩增程序
   常用扩增程序如下：

• 初始变性：95℃ 2分钟；

• 循环阶段：95℃ 15秒，60℃ 1分钟，共40个循环；

• 熔解曲线（如需）：60–95℃，每步0.3℃递增。

5. 设置荧光采集

• 选择在退火或延伸阶段采集荧光信号；

• 选择采集频率与通道。

6. 保存与运行
   点击“Start Run”，系统开始加热循环并实时采集信号。

六、实时监控与数据采集

实验运行过程中，QuantStudio 5可实时显示扩增曲线与温度曲线。

• 实时图形界面：显示每个循环的荧光变化趋势；

• 样品状态显示：不同颜色代表不同检测通道；

• 系统日志：记录温控、光学采集与软件分析的实时数据。

用户可随时暂停实验查看数据或修改显示模式。

七、实验结果分析

1. 扩增曲线分析
   软件自动生成荧光强度–循环数曲线（S型曲线），用户可检查基线与阈值位置。

2. Ct值计算
   当荧光信号超过阈值时系统记录Ct值。Ct越小，模板量越高。

3. 标准曲线与扩增效率
   在绝对定量实验中，标准曲线R²应≥0.99，扩增效率为90%–110%。

4. 相对定量分析（ΔΔCt法）
   软件自动计算目标基因与内参基因的相对表达倍数。

5. 熔解曲线分析
   用于SYBR Green实验中检测扩增特异性，单一峰值代表单一产物。

6. SNP分型结果
   通过不同通道荧光信号比对，自动区分等位基因。

7. 数据导出与报告生成
   结果可导出为Excel、CSV或PDF文件。报告包含扩增曲线、标准曲线、Ct表与统计分析结果。

八、维护与保养

1. 日常维护

• 实验结束后关闭电源；

• 清洁光学窗口与样品仓；

• 检查反应板残留与污染。

2. 周期性校准

• 每3个月执行一次光学校准；

• 每6个月执行温度校准。

3. 系统更新

• 定期检查并安装最新软件与固件版本。

4. 存放要求

• 仪器长期不使用时，应覆盖防尘罩，保持干燥环境。

九、安全注意事项

1. 实验样品可能含有生物风险物质，操作时须佩戴防护手套与口罩；

2. 禁止在仪器运行中打开盖板；

3. 避免液体溅入仪器内部；

4. 使用经认证的反应板与密封膜；

5. 不得私自拆卸仪器内部结构。

十、常见问题与解决方法

十一、性能验证与质量控制

为确保实验结果可靠性，建议定期进行性能验证。

1. 重复性测试：同一样品三重复Ct标准差应≤0.3；

2. 温控均一性检测：孔间温差≤±0.25℃；

3. 光学通道一致性：荧光强度偏差≤2%；

4. 标准曲线验证：R²≥0.99，斜率在–3.1至–3.6之间。

十二、实验优化建议

1. 使用高纯度模板与新鲜试剂；

2. 优化引物设计，避免二聚体形成；

3. 模板浓度控制在合适范围（10¹–10⁶ copies/μL）；

4. 在冰上操作，避免酶失活；

5. 设置阴阳性对照孔，防止假阳性或假阴性结果。

十三、数据管理与云端功能

QuantStudio 5支持与Thermo Fisher Connect平台同步，实现远程管理：

1. 云端上传实验数据与报告；

2. 多用户权限管理与协作分析；

3. 自动备份防止数据丢失；

4. 可在平板电脑或计算机上远程查看结果。

十四、性能优势

1. 高灵敏度：最低检测限可达10拷贝DNA模板；

2. 高重复性：Ct标准差≤0.25；

3. 多通道检测：支持多重反应实验；

4. 操作简便：触控界面与图形化软件设计；

5. 数据可追溯：云端系统支持实验追踪与审计。