一、概述

QuantStudio 3实时荧光定量PCR仪是Thermo Fisher Scientific推出的智能型定量检测平台，广泛应用于基因表达分析、病原体定量、突变检测及拷贝数分析等分子实验。其核心功能之一是荧光信号的实时监测与定量计算。

在PCR扩增过程中，仪器通过光学系统采集每个循环的荧光信号，生成扩增曲线。为了从曲线中准确计算样品的Ct（Cycle threshold）值，系统必须设定一个固定阈值。Ct值代表荧光信号首次超过该阈值所对应的循环数，是定量分析的关键参数。

阈值设置是实时定量PCR数据分析的核心环节。正确的阈值能够准确反映模板浓度差异，提高定量结果的线性度与可靠性；错误的阈值可能导致Ct计算偏差，进而影响相对定量或绝对定量分析结果。

二、阈值的定义与意义

1. 定义

阈值（Threshold）是荧光信号达到可区分于背景噪声水平时的一个固定参考线。它通常位于扩增曲线的指数增长阶段，是区分特异性扩增信号与随机背景波动的关键标准。

在QuantStudio 3系统中，阈值以ΔRn（荧光信号变化量）为纵坐标，用水平线形式显示在扩增曲线上。

2. 数学意义

Ct值的确定过程遵循以下逻辑：

• 实时PCR系统记录每个循环的荧光强度Rn；

• 系统计算ΔRn = Rn（当前循环） – Rn（基线平均值）；

• 当ΔRn首次超过设定阈值时，对应的循环数即为Ct。

3. 阈值的重要性

阈值位置直接决定Ct值大小，从而影响定量结果。

• 阈值过低：Ct偏小，易产生假阳性；

• 阈值过高：Ct偏大，灵敏度下降；

• 合适阈值：应落在扩增曲线的指数增长中段，且远离背景噪声。

三、QuantStudio 3的阈值设定机制

QuantStudio 3软件提供两种阈值设定方式：自动阈值（Auto Threshold）与手动阈值（Manual Threshold）。

1. 自动阈值（Auto Threshold）

系统根据算法自动计算基线噪声并设定阈值位置。算法依据扩增曲线的背景荧光变化范围，在其平均值的若干倍标准差处设定阈值。

特点：

• 快速便捷，适合批量分析；

• 对标准实验体系准确性较高；

• 适合数据差异较小、曲线形态一致的实验。

不足：

• 对低拷贝样品或信号波动曲线敏感；

• 若存在异常孔或背景偏高样品，可能导致全板阈值偏移。

2. 手动阈值（Manual Threshold）

操作者可根据扩增曲线实际形态，在图形界面中手动调整阈值位置。

适用情况：

• 存在背景不一致或荧光漂移；

• 需对特定通道单独优化；

• 数据分析用于发表或质控报告时，要求阈值一致可控。

操作方法：

• 打开Analysis界面 → Amplification Plot；

• 选择“Manual Threshold”；

• 拖动水平线或输入数值调整阈值位置；

• 系统即时更新Ct值与相关统计。

四、基线（Baseline）与阈值的关系

1. 基线的概念

基线是PCR早期循环阶段的荧光信号平均值，代表背景噪声范围。通常在第3–15个循环内设定。

2. 关系与影响

基线确定了ΔRn的计算区间，阈值则在ΔRn的指数增长阶段取交点。若基线设定不当，将影响ΔRn计算结果，进而导致阈值偏移。

3. 基线调整原则

• 过短基线：会包含早期扩增信号，导致阈值过高；

• 过长基线：包含部分指数期数据，使Ct值偏小；

• 合理基线：应覆盖荧光稳定的背景区段，且不与指数期重叠。

五、阈值的选择原则

在QuantStudio 3系统中，阈值应依据以下原则设定：

1. 位于所有样品扩增曲线的指数增长区间；

2. 高于基线噪声至少10倍信号强度；

3. 不与背景信号交叉或触及平缓段；

4. 适用于所有样品组别与通道，确保可比性；

5. 调整后须重新生成Ct统计与标准曲线。

图像判定要点

• 曲线应在阈值线穿越点呈现陡直上升趋势；

• NTC（无模板对照）曲线不应跨越阈值线；

• 阈值应稳定、均一，不随单个孔的噪声波动调整。

六、不同实验类型下的阈值设置策略

1. SYBR Green体系

• 信号来自双链DNA结合染料，背景相对较高；

• 阈值宜略高于背景噪声上沿，以避免假阳性；

• 若曲线尾部上升过缓，可手动下调阈值。
  建议初始阈值：ΔRn 0.1–0.3。

2. TaqMan探针体系

• 信号由探针切割释放荧光产生，背景低；

• 阈值可设在扩增初期中段，约为ΔRn 0.05–0.2；

• 多通道实验中，各通道阈值应分别调整。

3. 多重检测实验（Multiplex）

• 由于不同染料光谱强度不同，需为每个通道独立设阈值；

• 建议统一Ct计算规则（如所有Ct取至小数点后一位）；

• 对信号较弱通道，宜适度降低阈值以确保检出率。

4. 绝对定量实验（Standard Curve）

• 阈值必须在所有标准样与未知样曲线中一致；

• 调整阈值后需重新计算标准曲线方程与R²；

• 最优阈值位置能使标准曲线斜率介于–3.1至–3.6。

5. 相对定量实验（ΔΔCt）

• 各靶基因与内参基因应使用相同阈值计算Ct；

• 若不同通道信号强度差异明显，应保持相对比例一致；

• 所有样品分析时阈值位置应锁定不变，以确保ΔCt可靠。

七、QuantStudio 3软件中的阈值调整操作

1. 进入分析界面

• 打开实验文件（.eds）；

• 进入“Analysis”标签页 → 选择“Amplification Plot”；

• 切换到目标通道。

2. 启用手动模式

点击“Auto Threshold”右侧开关，切换至“Manual”。

3. 调整阈值位置

• 可通过拖动水平线或输入数值进行微调；

• 推荐使用放大曲线视图，便于精确定位；

• 调整后系统实时更新Ct值与曲线标识。

4. 重新计算与保存

• 点击“Reanalyze”重新生成结果；

• 保存新分析版本（建议添加日期或版本号备注）；

• 导出报告文件时记录阈值数值以便追溯。

八、阈值优化实例

实例一：标准曲线实验

在对照系列浓度（10⁷–10¹ copies）实验中，自动阈值产生R²=0.982。手动上调阈值至ΔRn=0.15后，重新分析得R²=0.999，斜率–3.34，效率99.1%。
说明阈值调整能显著改善标准曲线线性。

实例二：低拷贝检测

在低模板样品中，自动阈值位置过高导致Ct>40。下调阈值至ΔRn=0.07后，曲线穿越点清晰，Ct=36.8且重复性良好。
表明合理下调阈值能提高检测灵敏度。

实例三：多重通道校正

FAM通道与VIC通道信号强度不同。分别设定FAM阈值0.12、VIC阈值0.20后，双通道Ct差异稳定在±0.3以内，实现信号均衡。

九、阈值错误设定的典型后果

因此，每次阈值调整后必须重新运行分析流程并核对结果。

十、优化与验证策略

1. 建立实验模板

在相同体系下建立固定阈值模板，后续实验可直接引用。

2. 对照验证

同时分析一批已知标准样，确认阈值位置能准确区分不同浓度间Ct差异。

3. 统计验证

计算重复孔Ct值标准差（SD≤0.3），验证分析稳定性。

4. 记录与追踪

在实验报告中注明阈值数值、设置方式及调整依据，以保证可追溯性。

十一、软件算法的优化机制

QuantStudio 3在自动阈值模式下使用动态背景校正算法：

1. 自动识别基线区段；

2. 计算每个孔的平均背景及标准差；

3. 取多孔平均形成全板阈值；

4. 根据曲线噪声幅度自适应调整阈值线高度。

该算法适合样品量大、体系一致性高的实验，但若样品差异显著，应手动优化。

十二、不同分析模式下阈值的一致性要求

十三、Ct值与阈值的关系数学模型

理论上，Ct值与模板初始拷贝数（N₀）呈负对数关系：

Ct=log⁡(Nt/N0)log⁡(1+E)Ct = \frac{\log(N_t/N_0)}{\log(1+E)}Ct=log(1+E)log(Nt/N0)

其中：

• NtN_tNt：阈值对应产物量；

• $E$：扩增效率。

当阈值设定改变时，Nₜ变化导致Ct整体平移，但若所有样品阈值一致，该平移不会影响相对关系。这说明阈值一致性比绝对数值更重要。

十四、常见问题与解决方法

十五、实际应用建议

1. 常规实验：使用系统默认Auto阈值即可；

2. 高精度分析（如发表数据）：使用手动阈值并统一板间参数；

3. 低拷贝检测：适当降低阈值，提高灵敏度；

4. 多重实验：为各通道独立设置阈值并记录；

5. 报告输出：在实验报告中标注阈值设定方式与数值，确保可复现性。

十六、阈值设置的质量控制

1. 定期验证

每季度使用标准样品检测，验证阈值与Ct计算稳定性。

2. 标准化文档

实验室应制定固定阈值设置SOP（标准操作程序），规定自动与手动阈值的使用条件。

3. 数据审核

在报告审核过程中，应由两名以上分析人员独立确认阈值位置合理。