赛默飞荧光定量PCR仪QuantStudio 3信号采集
一、信号采集的基本原理
实时荧光定量PCR的核心在于通过荧光信号强度变化来反映DNA扩增的过程。QuantStudio 3的信号采集原理基于荧光染料或探针在扩增体系中产生的荧光强度随产物数量变化而变化的特性。系统在每一循环的特定阶段（通常在延伸阶段）通过光学模块激发反应体系中的荧光分子，检测其发射光强度并记录数据，从而生成扩增曲线。
信号采集遵循以下基本过程：
激发光照射反应孔中的荧光分子；
荧光分子吸收能量后发射特定波长的光；
光学滤光片分离发射光并传递至检测器；
CCD相机采集光强并转换为数字信号；
软件处理信号，扣除背景噪声，输出荧光变化值（ΔRn）；
将每个循环的信号绘制为荧光曲线。
二、QuantStudio 3光学系统结构
QuantStudio 3采用高灵敏度光学检测模块和多通道LED激发系统，其光学系统由以下部分组成：
激发光源（LED Excitation System）
四通道高亮度LED光源（FAM、VIC、ROX、CY5），能提供稳定且均匀的激发光。
光强稳定性误差低于±2%，确保每个循环信号一致。
光学滤光片组（Optical Filter Sets）
FAM：Ex 470 nm / Em 520 nm
VIC：Ex 530 nm / Em 555 nm
ROX：Ex 575 nm / Em 610 nm
CY5：Ex 630 nm / Em 670 nm
每个通道配备专用激发滤光片与发射滤光片，防止光谱重叠。
通道配置如下：
光路系统（Optical Pathway）
采用固定光路与反射镜系统，实现激发光均匀分布。
光学信号通过多孔检测镜头同步采集，无需移动样品。
检测器（CCD Camera）
采用高灵敏度电荷耦合器件（CCD）传感器，可同时检测全板信号。
具备自动曝光与动态范围调节功能，信号捕获线性度高。
光学校准系统（Optical Calibration Unit）
内置光强监测与通道校正模块，确保通道间差异最小化。
三、信号采集的时序与控制
QuantStudio 3在PCR循环的特定阶段采集荧光信号，通常在退火延伸阶段（Annealing/Extension）进行。
采集过程分为以下步骤：
PCR循环开始，温度升至变性阶段（95℃）；
退火阶段温度降至目标温度（一般为55–65℃），荧光探针结合；
延伸阶段DNA聚合酶合成产物，同时荧光探针被切割产生荧光；
系统在每次延伸阶段末采集一次荧光信号；
采集数据传输至主控系统并实时绘制扩增曲线。
每个循环均采集一次信号，QuantStudio 3支持40至45个循环的连续检测，保证实时性与数据完整性。
四、采集模式与信号类型
QuantStudio 3支持两种主要信号采集模式：
SYBR Green模式
荧光染料与双链DNA结合后发出荧光，信号强度与DNA量成正比。
系统采集整个通道的发射光强度并生成扩增曲线。
适合单目标检测。
TaqMan探针模式
采用荧光报告基团（Reporter）与淬灭基团（Quencher）相连的探针。
扩增过程中探针被Taq酶切割，Reporter释放产生荧光。
适合多通道、多靶标检测。
此外，系统还支持ROX作为参考染料（Passive Reference），用于校正孔间体积差异与光学波动，保证Ct值稳定性。
五、信号采集算法与数据处理
QuantStudio 3的软件使用多层算法对采集信号进行处理，确保信号真实可靠。
基线校正（Baseline Correction）
自动识别扩增初期无荧光变化区间（通常为第3–15循环），扣除背景噪声。
ΔRn计算
计算方式：ΔRn = Rn（样品荧光强度） – Rn（基线平均值）。
ΔRn值反映每一循环的实际荧光变化幅度。
平滑算法
对采集信号进行曲线平滑处理，消除随机噪声。
Ct值确定
软件根据阈值线位置自动计算荧光曲线穿越阈值时的循环数。
信号归一化
以ROX信号为参考，校正不同孔间荧光强度偏差。
多通道信号分离
软件采用光谱解卷积算法（Spectral Deconvolution）分离各荧光通道信号，消除交叉干扰。
六、荧光通道的特性与应用
QuantStudio 3提供四个荧光检测通道，支持多重检测。
| 通道 | 激发波长 (nm) | 发射波长 (nm) | 常用染料 | 主要用途 |
|---|---|---|---|---|
| FAM | 470 | 520 | SYBR Green, FAM | 常规目标检测 |
| VIC | 530 | 555 | VIC, HEX | 内参或第二目标 |
| ROX | 575 | 610 | ROX | 参考染料 |
| CY5 | 630 | 670 | CY5 | 第三目标或特异性探针 |
软件可根据实验类型自动匹配通道设置，用户也可手动调整探针通道。
七、信号采集的灵敏度与动态范围
QuantStudio 3在信号检测灵敏度与动态范围上具备显著优势。
信号灵敏度
可检测低至10个拷贝的模板。
CCD探测器的最小可分辨光强变化约为1×10⁻⁵ AU。
动态范围
检测范围可覆盖7个数量级（10¹–10⁷ copies）。
保证Ct值线性相关系数R² ≥ 0.99。
线性响应性
荧光强度与DNA拷贝数呈严格线性关系。
八、信号校准与标准化
为确保信号采集的准确性，QuantStudio 3在出厂及使用过程中均需进行光学校准。
通道校准
使用官方校准板检测各通道荧光强度，修正光学增益差异。
光源强度调节
自动监测LED输出功率，维持稳定激发光强。
参考染料校正
以ROX信号为内参，消除孔间差异与温控偏移。
温度补偿
软件自动修正因温度变化导致的光学漂移。
周期性光学校准
建议每3–6个月执行一次系统校准。
九、信号采集质量控制
在信号采集过程中，以下参数用于评估信号质量：
信噪比（Signal-to-Noise Ratio, SNR）
理想SNR ≥ 3。信号低于此值需重新优化体系。
基线稳定性
前15个循环内信号波动应小于±0.05 ΔRn。
通道交叉干扰
通道间荧光泄漏率应低于2%。
重复孔一致性
相同样品重复Ct值差异应≤0.3。
曲线平滑度
扩增曲线呈连续上升，平台期平稳。
十、影响信号采集准确性的因素
模板浓度过低：导致信号微弱，Ct值偏高。
探针降解：荧光释放异常，曲线变形。
板膜密封不严：荧光信号不稳定。
反应体系气泡：光学反射导致信号波动。
光学窗口污染：降低信号强度。
荧光通道设定错误：信号采集偏移。
温控不均：孔间荧光差异加大。
十一、信号采集优化策略
严格控制反应体系体积与比例：保持体系一致性。
消除气泡：离心反应板前检测，避免反光干扰。
保持光学窗口清洁：实验前使用无尘布擦拭光窗。
优化荧光通道选择：避免光谱重叠的探针组合。
使用ROX参考染料：提升信号稳定性。
合理设定采集时间点：确保在延伸阶段信号最强时采集。
定期执行光学校准：维持通道平衡与信号一致性。
十二、信号采集与扩增曲线分析的关系
信号采集结果直接决定扩增曲线形态和Ct值。
若采集信号过弱，曲线呈缓慢上升或不规则形状；
若采集时间点错误，曲线斜率偏低；
若信号漂移或背景高，Ct值会提前出现；
通过稳定的采集流程可获得典型“S形”扩增曲线。
QuantStudio 3软件通过实时监控采集信号，可即时生成扩增曲线，供用户判断反应是否正常。
十三、信号采集与多重检测
QuantStudio 3支持多通道并行信号采集，实现多靶标共扩增。
同步采集机制：CCD同时捕获各通道信号，避免时间误差。
光谱分离算法：分解多通道信号，减少通道重叠干扰。
多重检测优化：每个通道信号强度应调整至相近范围，以防主通道信号淹没次通道信号。
荧光互补策略：选择光谱间隔大的染料组合，如FAM/ROX或FAM/CY5。
十四、信号采集在不同实验类型中的应用
基因表达分析：信号采集稳定性决定ΔCt计算精度。
绝对定量检测：标准曲线的线性依赖于信号采集一致性。
SNP分型：多通道信号分辨率决定等位基因区分能力。
病原体检测：弱信号样品对采集灵敏度要求高。
扩增效率验证：信号曲线的平滑性反映体系优化程度。
十五、信号采集的数据管理与可视化
QuantStudio 3软件提供多种信号数据展示模式：
实时采集界面：可在实验过程中实时观察信号变化。
放大曲线模式：放大单孔信号曲线进行噪声分析。
荧光分布热图：显示96孔荧光强度分布，便于检测异常孔。
通道对比视图：比较多通道信号同步性与干扰程度。
导出功能：支持信号数据导出为CSV格式进行后期处理。
十六、信号稳定性验证实验
为验证信号采集的可靠性，可进行如下测试：
重复性实验：同一样品重复三孔，Ct值差异应≤0.3。
光学稳定性实验：连续采集标准样品10次，ΔRn变化≤2%。
通道均一性测试：不同通道信号比值差异不超过±3%。
温控影响测试：恒温条件下信号波动≤0.1 ΔRn。
十七、信号采集的故障与排查
| 故障现象 | 可能原因 | 排查措施 |
|---|---|---|
| 信号极弱 | 探针降解或染料浓度不足 | 更换探针或增加浓度 |
| 信号漂移 | 光学窗口污染 | 清洁窗口 |
| 通道不工作 | 滤光片损坏或设置错误 | 检查通道配置 |
| 曲线异常抖动 | CCD受干扰或环境震动 | 稳定仪器位置 |
| Ct值异常提前 | 背景过高或阈值设置错误 | 重新调整阈值与基线 |
十八、信号采集系统维护
每次实验后清洁光学窗口和样品仓。
每月执行一次通道校准与光源强度检测。
定期备份光学配置文件。
若检测信号衰减，应联系工程师更换LED光源或校准CCD。
十九、信号采集与实验 reproducibility 的关联
实验可重复性（Reproducibility）是评估仪器性能的重要指标。
稳定的信号采集系统保证不同时间、不同批次实验中Ct值的一致性。
QuantStudio 3通过高精度光学系统、恒温模块及信号算法优化，使实验重复性Ct标准差保持在0.25以内，满足科研与临床检测要求。
