赛默飞荧光定量PCR仪QuantStudio 3实验注意事项
一、概述
QuantStudio 3实时荧光定量PCR仪是Thermo Fisher Scientific公司推出的中通量实时定量检测系统，具有高灵敏度、高通量、操作简便和数据分析智能化等优势。其应用范围涵盖基因表达分析、病原体检测、突变分型、拷贝数变异和药物靶点筛查等领域。
然而，即便是性能先进的PCR仪，也需要严格遵循操作规范。荧光定量PCR实验对操作细节极其敏感，微小的偏差都可能导致Ct值漂移、扩增曲线异常或结果误判。掌握QuantStudio 3的实验注意事项，能有效提高检测准确性、降低误差并延长仪器使用寿命。
本文将从实验前准备、样品处理、体系配制、仪器操作、数据分析、维护保养等多个层面，系统阐述QuantStudio 3实验过程中的关键注意事项。
二、实验前准备
1. 实验室环境要求
实验室应保持恒温20–25°C，相对湿度低于70%；
避免阳光直射和强风环境，防止光学信号干扰与温度波动；
实验区应分区管理，包括试剂准备区、样品处理区、扩增检测区三部分，禁止交叉操作；
使用超净工作台或PCR专用操作台进行样品与体系制备，防止气溶胶污染。
2. 电源与设备检查
确保QuantStudio 3连接稳压电源，电压波动不超过±5%；
开机前确认设备状态正常，电源指示灯亮，触屏响应灵敏；
检查温控模块与上盖是否干净无划痕；
定期进行系统自检（Self-Test）以确认光学通道与温度模块正常。
3. 校准状态确认
在实验前应检查光学校准（Optical Calibration）与温控校准（Thermal Verification）状态；
若仪器长时间未使用（>3个月），建议重新进行光学及热循环校正；
确认通道灵敏度平衡，防止不同荧光信号强度偏差。
三、样品处理注意事项
1. 模板提取与纯度控制
模板DNA或cDNA应具备高纯度（A260/A280=1.8–2.0）；
RNA模板需经DNase处理，避免基因组DNA干扰；
对环境样品或临床样品应采用专用提取试剂盒，防止抑制物残留；
模板应避光、低温保存（–20°C），使用前完全融化并混匀。
2. 模板浓度与稀释
模板浓度过高可能导致非特异扩增，过低则信号不稳定；
建议稀释至1–10 ng/反应（DNA）或等效1–100 ng（cDNA）；
稀释使用无核酸酶水或低EDTA TE缓冲液；
稀释后模板应小体积分装，避免反复冻融。
3. 防止污染
所有操作使用一次性滤芯吸头；
样品加样区与扩增区必须分开；
定期使用10%漂白液或75%乙醇清洁工作台；
实验后应对移液器进行紫外灭菌处理。
四、试剂与体系配置注意事项
1. 试剂准备
所有试剂应在冰上操作，避免长时间室温放置；
冻存试剂使用前完全融化并轻轻混匀，不可剧烈震荡；
检查有效期与保存条件，过期或反复冻融超过3次的试剂不得使用；
使用专用Master Mix（如PowerUp SYBR Green或TaqMan Fast Advanced）。
2. 引物与探针
引物浓度建议0.2–0.5 μM，探针浓度0.1–0.25 μM；
避免高GC含量或二聚体结构；
若采用多重检测，探针荧光染料应选择光谱分离良好的组合（如FAM/VIC/ROX/Cy5）。
3. 体系配置顺序
建议先配制Master Mix，再加入模板；
每次实验应留出10%余量，防止移液损耗；
加样顺序固定，避免孔位错乱；
加样后轻轻敲打或短暂离心，使液体集中于孔底。
4. 对照设置
NTC（无模板对照）：用于检测污染；
阳性对照：用于验证体系有效性；
内参基因对照：用于相对定量分析校正；
标准品系列：用于绝对定量标准曲线建立。
五、反应板与封膜操作
1. 板材选择
2. 封膜技巧
封膜前确保孔口无气泡与液滴；
使用压膜器平稳覆盖，避免皱褶与气泡；
贴膜后轻压确保密封严实，防止蒸发；
不得重复粘贴或二次封膜。
3. 离心步骤
加样及封膜后进行短暂离心（1000–2000 rpm，30秒），使反应体系完全沉底并排除气泡。
六、仪器操作注意事项
1. 板架安装
确认模块温度与实验板匹配（96孔标准板对应标准模块）；
轻放反应板，确保四角贴合平整；
上盖关闭时应均匀施力，不可斜压或用力过猛。
2. 程序设置
设定正确的反应体系（SYBR Green或TaqMan Probe）；
检查荧光通道配置与采集点；
程序包括初始变性、循环扩增及熔解曲线；
退火温度需与引物Tm值相符（一般为55–65°C）。
3. 运行监控
启动实验后不得随意开盖；
实时观察扩增曲线，若信号异常可暂停检测并记录原因；
若中途断电，仪器会保存已完成循环数据，但建议重新实验以保证完整性。
七、数据分析与结果判定
1. 基线与阈值设置
自动分析模式适用于常规实验；
若曲线漂移或背景高，可手动调整阈值线，使其穿越指数增长区；
基线范围建议在3–15个循环之间，避免包含扩增信号。
2. Ct值判定标准
有效Ct范围一般为15–35；
Ct＞38表示模板量极低或假阳性；
NTC应无信号或延迟Ct＞40，否则存在污染。
3. 熔解曲线分析（SYBR体系）
单一尖锐峰表示扩增特异性良好；
多峰或肩峰代表非特异产物或引物二聚体，应重新设计引物或调整退火温度。
4. 标准曲线验证
线性相关系数R²≥0.99；
扩增效率在90–110%之间；
斜率应介于–3.1至–3.6之间。
5. 相对定量计算
采用ΔΔCt法：
ΔCt=Ct目标基因−Ct内参基因ΔCt = Ct_{目标基因} - Ct_{内参基因}ΔCt=Ct目标基因−Ct内参基因ΔΔCt=ΔCt样品−ΔCt对照ΔΔCt = ΔCt_{样品} - ΔCt_{对照}ΔΔCt=ΔCt样品−ΔCt对照表达倍数=2−ΔΔCt表达倍数 = 2^{-ΔΔCt}表达倍数=2−ΔΔCt
6. 结果导出
数据可导出为PDF、Excel或EDS格式；
建议保存原始数据文件以便后期复核与分析。
八、常见实验错误与预防
| 问题 | 可能原因 | 预防与解决措施 |
|---|---|---|
| Ct值漂移大 | 加样不均或温控偏差 | 使用Master Mix并校准仪器温度 |
| 扩增曲线不典型 | 模板质量差或抑制物存在 | 纯化模板并适度稀释 |
| 信号过弱 | 染料降解或通道选择错误 | 检查荧光通道设置 |
| 熔解曲线多峰 | 引物二聚体或退火温度过低 | 提高退火温度或优化引物 |
| 背景高 | 封膜反光或污染 | 使用合格耗材并清洁模块 |
| NTC阳性 | 气溶胶污染 | 严格分区操作并更换吸头 |
九、仪器维护与保养
1. 日常维护
每次实验后清理温控模块与光学窗口，使用无水乙醇擦拭；
检查上盖加热表面是否光滑无污点；
定期清理风口与通风区域，保持散热顺畅。
2. 光学系统维护
禁止使用含强酸或强碱的清洁剂；
若荧光信号明显衰减，需执行光学校准；
定期检测各通道信号强度，记录变化趋势。
3. 软件维护
定期更新QuantStudio Design & Analysis软件；
升级前备份所有实验数据；
使用Thermo Fisher Cloud同步数据，避免文件丢失。
4. 存放与环境
长期停机时，应关闭电源并覆盖防尘罩；
保持实验室环境干燥清洁；
避免仪器暴露在高湿或腐蚀性气体环境中。
十、安全与合规注意事项
实验操作应遵守实验室生物安全规范（如BSL-2标准）；
样品若含传染性病原体，应在专用安全柜内操作；
使用化学试剂（如乙醇、漂白液）时佩戴防护手套与护目镜；
严禁将含有扩增产物的反应板或废液带入样品制备区；
定期对实验人员进行QuantStudio操作与维护培训。
十一、性能验证与质量控制
1. 定期验证实验重复性
同一样品三重复孔Ct值标准差≤0.3；
若超出范围，应检查加样误差与反应体系均匀性。
2. 使用标准品监控
采用已知浓度标准品评估扩增效率；
检查批次间差异并记录趋势。
3. 内参基因稳定性检测
对相对定量实验，应先验证内参基因（如GAPDH、ACTB）Ct值稳定性；
Ct标准差≤0.2为合格。
十二、优化实验精度的细节
使用同批次试剂进行系列实验以减少批间差异；
样品与试剂配制在冰上完成，防止酶活失衡；
扩增板加样顺序一致，减少系统误差；
每次实验记录模板浓度、反应体系、仪器设置及软件版本，保证可追溯性；
若进行多实验比较，应使用相同的反应体系和程序模板。
十三、数据记录与存档
每次实验后将原始数据、分析报告与参数记录保存至实验室服务器；
实验数据应包括日期、操作者、模板来源、体系配比、程序参数与结果；
纸质报告应打印并签字归档至少三年。
