赛默飞荧光定量PCR仪QuantStudio 3样品布局
一、样品布局的基本概念
样品布局是指在96孔反应板上，将实验样品、阴阳性对照、标准梯度、内参基因及靶标基因按照特定逻辑分配至不同孔位的过程。QuantStudio 3的软件通过样品布局表（Sample Setup）将物理孔位与样品信息相对应，并在分析阶段自动识别样品类型和通道信号。
样品布局的核心作用包括：
明确样品与反应孔的映射关系；
关联样品名称、目标基因、检测通道与反应类型；
便于后续Ct值、ΔCt和ΔΔCt计算；
实现自动报告生成和结果分类；
提高数据统计和重复性分析效率。
二、QuantStudio 3样品布局的分类
QuantStudio 3的软件支持多种实验类型和布局模式，主要分为以下几类：
基因表达实验（Relative Quantification）
常用于比较不同处理组间目标基因相对表达量。
需设置目标基因与内参基因布局。
绝对定量实验（Standard Curve Quantification）
需设置标准品梯度样品及未知样品位置。
软件自动生成标准曲线。
SNP分型实验（Genotyping）
设置双通道（FAM/VIC）用于区分不同等位基因。
样品布局需与探针通道对应。
病原体检测（Pathogen Detection）
设置阳性、阴性和样品孔位。
可采用多靶标多通道检测方式。
多重PCR实验（Multiplex PCR）
不同荧光通道对应不同靶标，样品布局需保持通道一致。
三、样品布局的基本元素
QuantStudio 3样品布局主要包含以下要素：
孔位编号（Well ID）
系统默认从A1到H12，共96孔。
每个孔位对应一个独立反应体系。
样品名称（Sample Name）
用户定义样品标识，如“Control_1”、“Treatment_2”。
支持批量命名或自动编号。
目标基因（Target Name）
指待检测的DNA或RNA基因名称。
每个孔可分配一个或多个靶标。
任务类型（Task Type）
包括未知样品（Unknown）、标准品（Standard）、阳性对照（Positive Control）、阴性对照（Negative Control）等。
荧光探针通道（Reporter Channel）
对应具体荧光染料，如FAM、VIC、ROX、CY5。
每个通道代表一个检测基因或探针。
重复孔（Replicates）
同一样品可设置多个孔位以提高结果可靠性。
反应类型（Assay Type）
可选择TaqMan探针体系或SYBR Green染料体系。
参考基因（Reference Gene）
在相对定量实验中用于归一化计算。
四、样品布局设计的原则
逻辑清晰、分区合理
样品分组应符合实验设计逻辑，便于后续分析。例如，A1–A3为阴性对照，B1–B3为阳性对照，C1–H12为实验样品。重复性与对称性
每个样品至少设置三个重复孔，孔位应分布均匀，避免边缘效应。避免温度梯度偏差
同一组样品应尽量放置在相邻区域，避免边缘孔温控误差。对照与样品分离
阴阳性对照放置在不同区域，防止交叉污染。多通道实验对应一致
多重检测时确保不同通道的样品位置完全对应。梯度稀释布局规则
绝对定量实验中，标准品浓度应按从高到低顺序排布，便于绘制标准曲线。
五、QuantStudio 3软件中的样品布局操作流程
QuantStudio 3的Design & Analysis软件提供可视化的样品布局编辑界面，用户可通过以下步骤完成配置：
创建实验模板
打开软件后选择实验类型（如Relative Quantification），输入实验名称与项目描述。设置检测方法
选择TaqMan或SYBR Green体系，并确认荧光通道设置。进入“Sample Setup”界面
软件显示96孔板布局图，可点击或拖动选择孔位。分配样品与靶标
在左侧菜单中输入样品名称与靶标名称，并分配至指定孔位。样品可批量分配；
靶标可拖拽至多个孔位。
定义任务类型
选择样品类型：Unknown、Standard、Positive Control或Negative Control。设置荧光通道
为每个靶标分配特定的Reporter（如FAM）与Quencher（如NFQ-MGB）。保存模板
完成布局后保存为模板文件（.edt格式），可重复使用。检查布局完整性
软件提供“Validation”功能，自动检测未分配孔位或命名重复。实验运行
完成布局设置后将模板导入仪器控制系统并启动实验。
六、常见样品布局模式实例
1. 相对定量（ΔΔCt法）布局示例
| 行列 | 样品名称 | 目标基因 | 通道 | 类型 | 备注 |
|---|---|---|---|---|---|
| A1–A3 | Control_1 | GAPDH | VIC | 内参 | 三重复 |
| B1–B3 | Control_1 | Target_X | FAM | 目标基因 | 三重复 |
| C1–C3 | Treatment_1 | GAPDH | VIC | 内参 | 三重复 |
| D1–D3 | Treatment_1 | Target_X | FAM | 目标基因 | 三重复 |
该布局确保每个样品既检测目标基因又检测内参，软件自动计算ΔCt与ΔΔCt。
2. 绝对定量标准曲线布局
| 行列 | 样品名称 | 浓度（copies/μL） | 目标基因 | 通道 | 类型 |
|---|---|---|---|---|---|
| A1–A3 | Std_1 | 10⁶ | Target_Y | FAM | Standard |
| B1–B3 | Std_2 | 10⁵ | Target_Y | FAM | Standard |
| C1–C3 | Std_3 | 10⁴ | Target_Y | FAM | Standard |
| D1–D3 | Unknown_1 | — | Target_Y | FAM | Unknown |
七、样品布局的质量控制要点
孔间重复差异检测
在软件分析结果中检查重复孔Ct标准差，应≤0.3。标准曲线质量评估
R² ≥ 0.99，扩增效率90%–110%为合格。内参稳定性检查
内参基因Ct值波动不应超过±0.5。阴阳性对照监控
阴性对照不得出现Ct值，阳性对照应Ct值稳定。板边缘效应排查
检查A1、H12等边缘孔Ct是否偏差明显，必要时重新分布样品。
八、样品布局与数据分析的关联
QuantStudio 3软件可根据样品布局自动识别和归类实验数据：
数据关联
每个孔的Ct值自动映射至对应样品与靶标。计算ΔCt与ΔΔCt
软件根据内参和样品类型自动生成相对表达结果。分组统计
样品组别由布局表定义，分析结果自动汇总平均值与标准差。图表输出
可生成扩增曲线、标准曲线及柱状图，直接反映布局设计逻辑。
九、样品布局的高级应用
批量模板导入
可在Excel中创建样品布局表，通过“.csv”格式导入至QuantStudio软件。跨实验布局模板
不同实验可共用同一布局模板，保持数据结构一致。多通道并行分析
通过FAM、VIC、ROX、CY5四通道实现多靶标同时检测。实验自动化
与Thermo Fisher Connect云端平台结合，支持远程布局、任务分配与报告自动生成。
十、样品布局常见错误与解决方案
| 问题 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 样品名称重复 | 手动输入重复 | 使用自动编号或批量命名 |
| 通道未设置 | 忘记分配荧光通道 | 在Sample Setup中手动选择Reporter |
| 未分配任务类型 | 系统无法识别样品 | 检查Task栏是否填写 |
| 阴阳性对照反向 | 布局错误 | 重新检查实验逻辑 |
| 数据缺失 | 布局文件未导入 | 重新加载.edt模板 |
| 重复孔Ct差异大 | 移液误差或气泡 | 检查移液操作并离心反应板 |
十一、样品布局的优化策略
分区布局原则
按样品组别或靶标基因划分区域，如A–C行为对照组，D–H行为实验组。均衡布局设计
避免相同样品集中在边缘孔，确保热循环均匀性。自动命名功能
使用软件的自动递增功能快速批量命名样品。模板重用
将常用实验布局保存为模板，提高后续实验效率。通道命名标准化
对多靶标实验，统一通道与靶标对应关系（如FAM-Target A，VIC-Target B）。
十二、样品布局与实验可靠性
良好的样品布局设计直接决定实验的重复性与准确性。
科学布局可减少系统误差：合理的孔位分布避免边缘温差导致Ct值偏差。
提高数据分析效率：布局文件自动关联数据，省去人工分组工作。
减少人为失误：模板化布局可防止重复命名、通道错误等常见问题。
增强实验追溯性：布局记录是实验报告的重要组成部分，可追踪样品与孔位对应关系。
十三、实验记录与报告管理
布局文件归档
每次实验的样品布局应与实验结果文件（.eds）一并保存。报告生成
QuantStudio软件可自动生成包含布局图、Ct值表、扩增曲线和结果分析的报告。云端备份
通过Thermo Fisher Connect平台实现布局与数据的云端存储与共享。
十四、实验室管理中的布局标准化
建立标准化的样品布局制度是实验室质量管理的重要环节。
统一命名规则：采用“样品类型_编号_日期”格式。
规范模板编号：每个布局模板设置唯一编号。
布局审核机制：实验前由第二操作者复核布局表。
版本管理：布局模板定期更新并存档。
仪器兼容性测试：新布局模板须在QuantStudio 3上验证兼容性。
