赛默飞荧光定量PCR仪QuantStudio 3模板稀释

QuantStudio 3实时荧光定量PCR仪（Real-Time PCR System）是Thermo Fisher Scientific公司推出的高性能分子检测设备，广泛应用于基因表达分析、病原体定量、突变检测、拷贝数分析及药物筛选等领域。在这些应用中，模板稀释是确保PCR反应线性范围、信号准确性与扩增重复性的关键步骤之一。

产品详细

一、概述

模板稀释的目的是将样品DNA或cDNA浓度调至适合PCR反应的范围，使扩增曲线稳定、Ct值线性、荧光信号准确。不同实验类型（如绝对定量或相对定量）对模板浓度的要求各不相同，但核心原则是一致的：保证浓度适中、杂质低、分布均匀、重复性高。

QuantStudio 3拥有高灵敏度的光学检测系统，其检测下限可达1–10拷贝。若模板浓度过高或过低，都会导致Ct值偏差、曲线异常或扩增效率下降。因此，掌握科学的模板稀释方法对于获得高质量实验结果至关重要。

二、模板稀释的重要性

1. 保证扩增反应线性范围

定量PCR的精度依赖于扩增效率的线性。模板过浓会造成反应提前进入饱和期，Ct值过小且不符合线性关系；模板过稀则可能导致信号噪声大，扩增曲线不完整。通过稀释，使模板量处于对数扩增区间，从而建立稳定的标准曲线。

2. 减少抑制效应

样品中可能含有蛋白质、盐离子、表面活性剂或有机物残留等抑制因子，直接使用高浓度模板容易影响Taq酶活性。稀释能降低抑制物浓度，提高扩增效率。

3. 提高重复性与可比性

实验中常需多次检测或不同批次比对。模板稀释可保证浓度一致，使重复孔间Ct值差异不超过±0.3，提高数据可比性。

4. 降低误差与假阳性

稀释能减少模板中残留的污染DNA或非特异序列影响，避免假阳性或熔解曲线多峰现象。

三、模板类型与初始浓度

QuantStudio 3可使用多种类型模板，包括：

基因组DNA（gDNA）：常用于拷贝数变异或多态性研究；
cDNA：通过逆转录RNA获得，用于基因表达分析；
质粒DNA或合成标准DNA：用于建立标准曲线；
RNA（经逆转录）：用于病毒载量检测或基因表达分析。

1. 初始浓度参考范围

模板类型	原始浓度范围	定量PCR推荐浓度
基因组DNA	50–200 ng/μL	1–10 ng/反应
cDNA	100–1000 ng/μL	1–100 ng/反应
质粒DNA	10⁸–10¹⁰ copies/μL	10³–10⁷ copies/反应
RNA（经逆转录）	0.5–5 μg/μL	稀释后取1–100 ng等效量

模板的浓度应根据反应体系（通常20 μL）按比例调整。

四、模板稀释溶液的选择

模板稀释液不仅用于稀释，还能保护核酸稳定性并防止吸附损失。常用稀释溶液如下：

稀释液类型	组成	特点与用途
无核酸酶水（Nuclease-free water）	超纯水	适用于大多数实验，操作简便；不含盐离子与抑制物
TE缓冲液（10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0）	缓冲体系	稳定DNA结构，适合长期保存稀释模板
Low-EDTA TE缓冲液	降低螯合剂浓度	用于Mg²⁺敏感体系，如实时PCR反应前稀释
1× PBS或Tris缓冲液	生物样品特定体系	对某些RNA模板或细胞裂解物更稳定

建议使用无核酸酶水或低EDTA TE缓冲液进行稀释，以兼顾稳定性与兼容性。

五、模板稀释步骤

1. 计算稀释倍数

模板稀释遵循以下基本公式：

$C1×V1=C2×V2C_1 \times V_1 = C_2 \times V_2$

其中：

$C_1$ ：原液浓度
$V_1$ ：取用体积
$C_2$ ：目标浓度
$V_2$ ：最终体积

例如，若模板原浓度为100 ng/μL，需稀释至每反应5 ng，每反应加2 μL，则稀释浓度应为2.5 ng/μL。
可计算稀释倍数为100 ÷ 2.5 = 40倍。

2. 稀释操作流程

取核酸样品，轻轻混匀；
按计算体积加入稀释液至无核酸酶离心管中；
轻轻颠倒混匀或短暂低速离心，不可剧烈振荡；
分装为小体积（如20–50 μL）防止反复冻融；
标注样品编号、稀释倍数与日期。

3. 稀释比例示例

原液浓度	目标浓度	稀释倍数	操作说明
100 ng/μL	10 ng/μL	10×	取10 μL模板 + 90 μL稀释液
100 ng/μL	1 ng/μL	100×	取10 μL模板 + 990 μL稀释液
100 ng/μL	0.1 ng/μL	1000×	分两步稀释：先10×后100×

建议分级稀释以减少操作误差。

六、标准曲线模板稀释

在绝对定量实验中，需要建立标准曲线以推算未知样品拷贝数。

1. 拷贝数计算

对于质粒模板，其拷贝数计算公式为：

$\frac{(C \times 6.022 \times 10^{23})}{(N \times 660)}$

其中：

$C$ ：模板质量（g/μL）；
$N$ ：质粒长度（bp）；
660为每碱基平均分子量。

例如，质粒长度为5000 bp，浓度为10 ng/μL，则每μL约含1.8×10⁹拷贝。

2. 梯度稀释设计

建议使用10倍系列稀释建立标准曲线（如10⁷–10¹ copies/μL），每个稀释点检测三重复孔。

梯度编号	拷贝数 (copies/μL)	稀释倍数
S1	1×10⁷	原液
S2	1×10⁶	10×
S3	1×10⁵	100×
S4	1×10⁴	1000×
S5	1×10³	10000×
S6	1×10²	100000×

该系列可覆盖绝大多数样品浓度范围，便于建立高相关性标准曲线。

七、模板稀释的实验验证

1. 测试Ct值线性

绘制Ct值与log（拷贝数）的标准曲线，线性关系应满足：

R² ≥ 0.99
斜率介于–3.1 至 –3.6（对应效率90–110%）

若偏离此范围，应重新检查稀释精度或反应体系。

2. 检查重复性

重复孔Ct差异应≤0.3，标准偏差小于0.2。差异过大说明加样或稀释误差。

3. 检查模板稳定性

储存稀释模板于–20°C，可保存3–6个月；避免反复冻融超过3次。

八、常见问题与解决策略

问题	原因分析	解决方案
Ct值异常升高	模板过稀或降解	提高模板浓度或重新提取
Ct值波动大	稀释不均或操作误差	采用分级稀释并混匀充分
曲线不线性	稀释倍数错误或加样不均	重新计算并确认移液精度
熔解曲线多峰	污染或非特异性扩增	检查样品纯度与引物特异性
背景信号高	稀释液污染或荧光染料过量	更换稀释液或优化体系
重复孔差异>0.5	模板稀释浓度差异或加样偏差	重新配制稀释液，使用Master Mix

九、稀释操作中的精确性控制

1. 使用高精度移液器

定期校准移液器，推荐使用0.1–10 μL和10–100 μL范围型号。

2. 采用低吸附离心管

防止核酸吸附壁面，保持稀释比例稳定。

3. 统一稀释温度

在低温（4°C）条件下进行稀释，减少核酸降解。

4. 使用分级稀释法

对于高浓度样品，分两步或多步稀释以减少误差累积。

5. 重复检测确认

首次实验可对关键浓度进行两次独立稀释，以确认结果一致性。

十、模板稀释与实验类型的配合

1. 绝对定量实验

使用系列稀释的标准质粒建立标准曲线；
稀释倍数应覆盖样品可能浓度范围；
计算模板拷贝数需结合稀释系数。

2. 相对定量实验

模板量控制在内参基因与目标基因Ct值相近；
cDNA常稀释5–20倍；
所有样品应使用同一稀释倍数，保持一致。

3. 病毒载量检测

高载量样品可预稀释10⁴–10⁵倍以避免信号饱和；
低载量样品可直接使用原液或仅2倍稀释。

4. 拷贝数变异分析

稀释模板以保持Ct值处于20–30范围；
使用同源参考基因模板作为比较对象。

十一、模板稀释的保存与管理

项目	要求	说明
保存温度	–20°C	长期储存
短期使用	4°C	1周内使用完
避光处理	建议	防止紫外降解
管体积	≤1 mL	减少冻融损失
批次标记	日期、稀释倍数	便于追踪
冻融次数	≤3次	超过次数可能影响定量准确性

模板稀释液应单独存放，避免与浓模板或扩增产物接触，以防交叉污染。

十二、稀释结果对实验性能的影响

线性关系改进：合理稀释可使标准曲线R²提高至0.999以上；
灵敏度提升：低浓度模板仍能被准确识别，Ct值稳定；
重复性增强：标准偏差减小，结果更可重复；
特异性优化：过高模板量引发的非特异扩增显著减少；
系统误差降低：均一稀释消除了孔间浓度差异。

十三、实验实例

案例一：基因表达分析

样品：人肝组织cDNA
原浓度：500 ng/μL
目标浓度：每孔2 ng
稀释计算：500 ÷ 2 = 250倍，操作分两步：

第一步：10 μL模板 + 90 μL稀释液（10×）
第二步：10 μL稀释液1 + 240 μL稀释液（25×）
最终模板浓度2 ng/μL。
结果：Ct值24.8±0.2，熔解曲线单峰。

案例二：病毒载量检测

标准模板浓度：10⁸ copies/μL
稀释系列：10⁸ → 10⁷ → 10⁶ → 10⁵ → 10⁴ → 10³ copies/μL
扩增效率：98%，R²=0.999，检测限达10 copies/反应。

十四、注意事项

稀释操作须在无核酸酶环境中完成；
若模板含RNA，应全程置于冰上；
每次实验新配稀释液，避免旧液引入杂质；
模板稀释液应在使用前充分混匀；
稀释过程应记录详细操作日志以确保追溯性。

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