一、扩增曲线的基本原理

实时荧光定量PCR的核心思想是在DNA扩增过程中实时检测荧光信号的变化。每个循环荧光强度的变化反映了目标DNA片段的累积量，最终绘制出荧光强度随循环数变化的曲线，即扩增曲线。

在QuantStudio 3系统中，荧光信号由光学检测模块捕获，通过CCD相机实时记录，软件自动生成信号曲线并进行基线校正与阈值计算。典型的扩增曲线由四个阶段组成：

1. 基线阶段（Baseline Phase）：初始循环，模板量极低，荧光信号未超出背景噪声范围；

2. 指数扩增阶段（Exponential Phase）：扩增效率接近100%，荧光信号呈指数增长；

3. 线性增长阶段（Linear Phase）：酶活性、底物浓度受限，扩增速度减缓；

4. 平台期（Plateau Phase）：反应体系耗尽，荧光信号趋于稳定。

Ct（Cycle Threshold）值位于曲线由背景上升至指数阶段的转折点，是荧光强度首次超过阈值时对应的循环数。Ct值是定量分析的核心指标，反映初始模板浓度。

二、QuantStudio 3扩增曲线的生成过程

QuantStudio 3通过以下步骤实现扩增曲线的采集与生成：

1. 热循环控制：仪器按照预设温度程序进行变性、退火和延伸，每个循环结束时采集一次荧光信号。

2. 荧光信号检测：LED光源激发反应体系中的荧光染料（如SYBR Green或TaqMan探针），CCD相机实时检测信号强度。

3. 数据采样与存储：系统以固定间隔记录每个循环的荧光值，形成时间序列数据。

4. 信号校正：软件自动进行背景扣除、光学漂移修正和基线拟合。

5. 曲线生成：将荧光强度（ΔRn）与循环数绘制成扩增曲线。

6. Ct计算与分析：系统根据阈值位置自动确定Ct点，进行定量计算。

QuantStudio 3采用高灵敏度光学系统，可同时检测多通道荧光信号（FAM、VIC、ROX、CY5），确保扩增曲线的准确性和稳定性。

三、扩增曲线的特征阶段分析

1. 基线阶段

在前10–15个循环中，荧光信号变化主要来自背景噪声，此阶段信号值随机波动。QuantStudio 3软件自动识别此区间并建立基线范围，用于后续计算ΔRn值。

2. 指数扩增阶段

该阶段为最关键的分析区间，荧光信号呈指数增长，Ct值即在此确定。曲线在此阶段应光滑、陡峭且线性上升。

3. 线性阶段

随着酶活性降低和底物消耗，扩增效率下降，曲线斜率减缓。

4. 平台期

体系反应趋于饱和，荧光信号保持稳定。平台高度可反映体系的荧光饱和水平。

理想的扩增曲线应呈典型的S形结构，基线平稳、上升陡峭、平台稳定。

四、扩增曲线的数学模型与Ct值计算

QuantStudio 3的软件通过算法对扩增曲线进行拟合，常用模型为指数增长函数：
F=F0×(1+E)nF = F_0 \times (1 + E)^nF=F0×(1+E)n
其中：

• F为第n循环的荧光信号；

• F₀为初始荧光值；

• E为扩增效率（理想值为1，即100%）；

• n为循环次数。

Ct值由荧光信号首次超过阈值线时的循环数确定。
软件通过以下步骤计算Ct：

1. 自动检测基线噪声并确定背景区间（通常为3–15循环）；

2. 在指数阶段设定固定阈值线（ΔRn阈值）；

3. 计算信号首次超过阈值的循环数；

4. 输出Ct值并进行定量分析。

Ct值与初始模板量呈对数负相关关系：
Ct=−1log⁡2(1+E)×log⁡2(Q0)+bCt = -\frac{1}{\log_2(1+E)} \times \log_2(Q_0) + bCt=−log2(1+E)1×log2(Q0)+b
其中Q₀为初始模板量，b为常数项。

五、QuantStudio 3扩增曲线分析的核心参数

1. ΔRn（荧光变化值）：表示荧光信号相对于基线的变化量，是曲线纵轴单位。

2. Threshold（阈值线）：设定荧光信号判定为阳性的固定值，系统自动或人工设置。

3. Baseline（基线区间）：计算背景噪声的循环区间。

4. Ct（阈值循环数）：曲线超过阈值时的循环数。

5. Efficiency（扩增效率）：通过标准曲线计算，理想范围为90%–110%。

6. Slope（斜率）：标准曲线的斜率，与扩增效率成负相关。

7. R²（相关系数）：衡量Ct值与模板浓度的线性关系，应≥0.99。

六、QuantStudio 3软件中的扩增曲线分析功能

QuantStudio 3配套的Design & Analysis软件提供多维度扩增曲线分析模块。

1. 实时曲线查看

在实验运行过程中，用户可实时监控荧光信号变化，判断体系是否扩增成功。

2. 自动Ct计算

系统根据默认算法自动设定基线和阈值，计算Ct值并输出表格。

3. 手动曲线调整

用户可调整阈值线位置或基线区间，观察Ct值变化，以优化数据。

4. 多通道显示

可同时显示FAM、VIC、ROX、CY5等通道曲线，用于多重PCR实验分析。

5. 数据导出与报告

软件支持将扩增曲线数据导出为.xls、.csv或.pdf格式，方便进一步分析与存档。

6. 图形化分析

通过叠加、放大或对比显示功能，可直观比较不同样品的曲线形态和Ct差异。

七、扩增曲线结果的典型判读

1. 理想曲线

• 基线平滑、指数上升明显、平台稳定；

• Ct值分布集中；

• 扩增效率在90%–110%。

2. 异常曲线类型

1. 迟发曲线：Ct值过高，说明模板量低或反应效率低；

2. 非特异性曲线：形态异常或无平台期，可能为污染或引物二聚体；

3. 信号漂移曲线：基线波动大，可能为荧光探针降解或光学污染；

4. 平台不稳定曲线：反应体系蒸发或温度均一性差；

5. 重复孔差异大：样品制备误差或移液不均匀。

3. 阴阳性判定

• 阳性样品：Ct值小于设定阈值（如35）且曲线符合S形。

• 阴性样品：无明显上升或Ct值超过设定范围。

八、扩增效率与标准曲线分析

标准曲线用于评估扩增效率与Ct值线性。
通过10倍梯度稀释模板，绘制Ct值与对数浓度的线性图。

• 理论斜率：–3.32，对应效率100%。

• 斜率在–3.1至–3.6之间为可接受范围。

• R²≥0.99表示线性良好。

扩增效率计算公式：
E=(10−1/slope−1)×100%E = (10^{-1/slope} - 1) \times 100\%E=(10−1/slope−1)×100%

QuantStudio 3软件可自动生成标准曲线，并计算效率和R²值，为结果定量提供依据。

九、影响扩增曲线质量的主要因素

1. 模板质量：降解或杂质污染模板会影响扩增起始点与曲线平滑度。

2. 引物设计：不合理的Tm值或二聚体结构导致非特异性信号。

3. 反应体系：Mg²⁺浓度、缓冲液pH、酶活性对扩增速率有显著影响。

4. 反应板密封性：蒸发导致孔间荧光不均。

5. 光学系统污染：灰尘或凝结水引起背景信号波动。

6. 仪器温控稳定性：温度不均会造成Ct漂移。

7. 荧光染料老化：信号衰减导致平台期波动。

十、扩增曲线优化策略

1. 优化引物浓度与退火温度：使用梯度PCR确定最佳条件。

2. 模板稀释：避免高浓度抑制扩增。

3. 使用高质量耗材：推荐使用赛默飞认证反应板与封膜。

4. 加强环境管理：保持设备清洁与室内恒温。

5. 合理设定阈值：确保Ct值定位在指数增长区。

6. 重复实验验证：每个样品设置三重复孔，以提高统计可信度。

7. 校准光学模块：定期执行光学校准，消除信号偏差。

十一、扩增曲线在不同实验类型中的应用

1. 相对定量实验（ΔΔCt法）

通过比较目标基因与内参基因Ct差值计算表达倍数，扩增曲线的平滑性与一致性是关键。

2. 绝对定量实验

根据标准曲线Ct值计算未知样品浓度。曲线线性决定定量精度。

3. SNP分型实验

通过双通道扩增曲线区分等位基因，信号重叠与交叉干扰会影响判型准确度。

4. 病毒载量检测

扩增曲线Ct与标准曲线比对，直接反映病毒浓度水平。

5. 扩增效率验证实验

通过分析不同模板浓度下曲线斜率，评估反应体系稳定性。

十二、扩增曲线分析的统计与可视化

QuantStudio 3提供多种可视化方式帮助用户解析扩增数据：

1. 叠加图模式：比较多样品曲线一致性；

2. 分通道图：展示各荧光探针的信号独立变化；

3. 对数坐标模式：便于识别指数扩增阶段；

4. 差异表达柱状图：展示相对表达倍数；

5. Ct分布图：直观呈现样品间Ct差异。

软件还能导出原始曲线数据至Excel或GraphPad Prism进行统计绘图和回归分析。

十三、常见问题与解决方案

十四、扩增曲线分析的质量控制

1. 设置阴阳性对照：确保体系无污染。

2. 监控重复孔SD：Ct标准差≤0.3为合格。

3. 验证扩增效率：标准曲线斜率接近–3.32。

4. 确认R²值：≥0.99表示线性良好。

5. 熔解曲线检查：确保扩增产物特异性。

6. 保存原始数据：便于长期追溯与分析。