赛默飞荧光定量PCR仪QuantStudio 3试剂配制
一、概述
QuantStudio 3实时荧光定量PCR仪是Thermo Fisher Scientific公司推出的中通量实时定量PCR系统，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、突变筛查、拷贝数变异研究及分子诊断等领域。该仪器以高灵敏度、高精度及智能化数据分析能力著称。然而，仪器的性能能否充分发挥，关键取决于试剂体系的科学配制与使用。
试剂配制是PCR实验的核心环节之一。反应体系中各组分的浓度比例、纯度及配制顺序直接影响扩增效率、特异性及信号稳定性。QuantStudio 3可兼容多种化学体系，包括SYBR Green染料法和TaqMan探针法，因此配制方案需根据检测方式、样品类型和实验目的进行优化。
二、试剂组成与功能
1. 核心组分
标准实时PCR反应体系通常包括以下组分：
| 组分 | 功能说明 | 典型终浓度 |
|---|---|---|
| DNA模板 | 提供扩增靶序列 | 1–100 ng DNA或等量cDNA |
| 引物（Forward/Reverse） | 特异识别目标序列两端 | 各0.2–0.5 μM |
| 探针（TaqMan法） | 提供荧光检测信号 | 0.1–0.25 μM |
| dNTP混合物 | 提供DNA合成的碱基原料 | 每种200 μM |
| MgCl₂ | 调节酶活性、稳定反应体系 | 1.5–3.0 mM |
| DNA聚合酶 | 催化DNA延伸反应 | 0.5–1.0 U/反应 |
| 缓冲液（Buffer） | 维持反应pH及离子强度 | 1× |
| 荧光染料 | 检测信号（SYBR Green或TaqMan探针） | 按体系要求 |
| 无核酸酶水 | 稀释及补足体系体积 | 补足至20 μL |
2. 体系体积
QuantStudio 3推荐反应体系体积为20 μL，也可根据反应板类型调整至10–50 μL。体积越小，对加样精度和板膜密封要求越高。
三、试剂类型与应用体系
1. SYBR Green染料体系
SYBR Green为非特异性双链DNA结合荧光染料，随PCR产物累积而发光。
主要优点： 操作简便、成本较低、适合基因表达定量；
主要缺点： 易受非特异扩增和引物二聚体影响。
典型配方（20 μL体系）：
| 组分 | 体积 (μL) | 终浓度 |
|---|---|---|
| 2× PowerUp™ SYBR Green Master Mix | 10.0 | 1× |
| Forward Primer (10 μM) | 0.4 | 0.2 μM |
| Reverse Primer (10 μM) | 0.4 | 0.2 μM |
| 模板DNA/cDNA | 2.0 | 1–100 ng |
| 无核酸酶水 | 7.2 | — |
| 总计 | 20.0 | — |
程序设置建议：
95°C 2分钟；
40个循环：95°C 15秒，60°C 30秒；
熔解曲线分析：60°C–95°C。
2. TaqMan探针体系
TaqMan探针法利用荧光探针特异性结合目标序列，扩增时被Taq酶切割产生荧光信号，特异性高，背景低。
适用于： 病原体定量、基因分型、突变检测等。
典型配方（20 μL体系）：
| 组分 | 体积 (μL) | 终浓度 |
|---|---|---|
| 2× TaqMan Fast Advanced Master Mix | 10.0 | 1× |
| Forward Primer (10 μM) | 0.4 | 0.2 μM |
| Reverse Primer (10 μM) | 0.4 | 0.2 μM |
| TaqMan Probe (10 μM) | 0.2 | 0.1 μM |
| 模板DNA/cDNA | 2.0 | 1–100 ng |
| 无核酸酶水 | 7.0 | — |
| 总计 | 20.0 | — |
程序设置建议：
95°C 20秒；
40个循环：95°C 1秒，60°C 20秒（荧光采集）。
四、试剂配制操作流程
1. 试剂准备
所有试剂应在冰上操作，避免高温降解。若使用冻存试剂，需完全融化后轻轻混匀，避免剧烈振荡导致酶活性损失。
2. 主混合液（Master Mix）配制
为了减少孔间误差，推荐先配制总量略多于所需反应孔数的Master Mix。
示例计算：
若需运行96孔实验，每孔20 μL，总体系需1920 μL。
考虑10%损耗，配制约2112 μL Master Mix。
Master Mix中除模板外的所有组分混合均匀，随后分装入反应孔，再加入模板。
3. 模板加入
模板应最后加入，以避免污染及保证体积一致。
建议使用过滤吸头并每次更换。加入模板后轻轻吹打混匀，避免气泡。
4. 反应板封装
加样完成后，用光学透明膜密封反应板。检查是否有气泡或液体溅出孔口，必要时短暂离心。
5. 保存与上机
若不能立即运行，可将反应板置于4°C保存不超过4小时。长期保存应在–20°C，避免冻融超过3次。
五、不同实验类型的配制要点
1. 基因表达定量实验
推荐使用SYBR Green或TaqMan体系。
需设置目标基因与内参基因两组反应；
内参常用GAPDH、β-actin、18S rRNA；
建议三重复孔以减少统计误差。
2. 病毒核酸检测
模板多为低拷贝RNA或DNA；
使用TaqMan探针体系提高特异性；
必须加入阴阳性对照；
建立标准曲线以实现绝对定量。
3. SNP基因分型
每个样品需双探针（FAM/VIC）体系；
探针终浓度应相等，确保信号平衡；
推荐使用TaqMan Genotyping Master Mix。
4. 拷贝数变异检测
使用目标基因与参照基因的双重探针体系；
模板需标准化稀释；
分析软件自动计算相对拷贝比例。
六、试剂配制中的关键控制点
1. 模板质量
模板应具备高纯度（A260/A280=1.8–2.0），无蛋白质或有机物污染。RNA模板须经DNase处理并反转录成cDNA。
2. 引物设计与浓度
长度：18–25 bp；
GC含量：40–60%；
Tm值差不超过1°C；
浓度过高易形成二聚体，过低导致扩增不足。
3. Mg²⁺浓度调整
Mg²⁺影响酶活性和特异性，过高易引起非特异扩增。建议通过梯度测试确定最佳浓度（1.5–3.0 mM）。
4. 酶与缓冲体系
应选用高保真热启动Taq酶体系（如PowerUp™ SYBR或TaqMan Fast Advanced）。酶量不足会降低扩增效率，过量则可能产生非特异性。
5. 荧光染料光敏性
SYBR Green和TaqMan探针均应避光保存和操作，使用深色离心管。
6. 阴阳性对照设置
阴性对照（NTC）：无模板，检测污染；
阳性对照：已知模板，验证体系可靠性。
七、试剂配制误差控制
1. 使用Master Mix
通过批量配制主混合液，减少单孔移液误差，提高一致性。
2. 校准移液器
定期校正移液器，防止量程误差影响Ct值。
3. 使用过滤吸头
防止气溶胶污染，避免交叉污染。
4. 操作环境分区
建立试剂准备区、模板加入区与扩增区，禁止交叉操作。
5. 离心操作
配制后短暂离心，使液体集中至孔底，保证体积一致。
八、常见问题与解决方案
| 问题 | 可能原因 | 解决方法 |
|---|---|---|
| 无扩增信号 | 模板降解或加样错误 | 检查模板质量，重新加样 |
| Ct值偏高 | 模板量过少或酶失活 | 增加模板或更换酶 |
| 扩增曲线异常 | 引物浓度过高、非特异扩增 | 重新优化引物或提高退火温度 |
| 多峰熔解曲线 | 引物二聚体或污染 | 设计新引物或更换耗材 |
| 背景信号高 | 染料过量或溶液污染 | 稀释染料或更换水源 |
| Ct重复性差 | 加样误差或体系不均 | 使用Master Mix并保证混匀 |
九、配制环境与耗材要求
1. 实验环境
温度20–25°C；湿度<70%；
使用无尘操作台或PCR专用操作台；
定期用75%乙醇清洁工作区；
禁止在配制区处理扩增产物。
2. 耗材要求
光学透明96孔PCR板（Thermo Fisher原装）；
光学封膜，避免气泡与反射；
无DNase/RNase离心管与吸头；
冰盒保持试剂低温操作。
十、优化与验证策略
1. 梯度PCR优化
利用QuantStudio 3的梯度功能（55–65°C），确定最佳退火温度与引物匹配度。
2. 标准曲线验证
使用10倍稀释模板建立标准曲线，确认扩增效率（E）与线性相关系数（R²）：
E=(10−1/斜率−1)×100%E = (10^{-1/斜率} - 1) × 100\%E=(10−1/斜率−1)×100%
理想范围：效率90–110%，R²≥0.99。
3. 内参标准化
对于相对定量分析，通过ΔΔCt法计算基因表达变化，确保内参Ct值稳定。
4. 重复性评估
每组样品至少设三重复，Ct标准差应≤0.3。
十一、试剂保存与管理
| 试剂类别 | 储存温度 | 注意事项 |
|---|---|---|
| Master Mix | –20°C | 避免反复冻融，分装保存 |
| 引物/探针 | –20°C | 避光保存，短期可置4°C |
| 模板DNA/cDNA | –20°C | 长期保存；避免冻融超过5次 |
| SYBR Green染料 | –20°C | 避光防氧化 |
| MgCl₂溶液 | 4°C | 密封防挥发 |
| 无核酸酶水 | 室温 | 开封后1个月内使用完毕 |
定期检查试剂有效期及批次差异，确保实验结果可比性。
十二、实际应用案例
1. 基因表达分析
目标基因：CYP1A1
体系：SYBR Green
模板：人肝细胞系cDNA 50 ng/反应
结果：Ct=22.3，效率98%，熔解曲线单峰。
2. 病毒核酸检测
靶标：HBV S基因
体系：TaqMan探针（FAM通道）
标准曲线范围：10¹–10⁷ copies
结果：线性R²=0.999，检测限10 copies/μL。
3. SNP分型
靶点：rs429358
体系：FAM/VIC双探针
结果：基因型三类清晰分布，通道信号平衡。
十三、试剂配制的安全与质量控制
操作人员应佩戴实验手套和护目镜，防止接触试剂；
使用的所有溶液必须无DNase/RNase污染；
每批次实验应包含阴阳性对照；
试剂开封后应标注日期与操作者；
定期记录配制参数与结果，用于实验追溯。
