一、系统概述

QuantStudio 3实时荧光定量PCR仪是Thermo Fisher Scientific公司推出的高性能定量PCR检测平台，其热循环系统是确保扩增反应高效、准确和可重复的核心模块。该仪器采用Peltier半导体控温模块，结合高精度温度传感器与智能PID控制算法，实现快速升降温与精确温度保持。

热循环参数（Thermal Cycling Parameters）指PCR扩增过程中各阶段温度、时间及循环次数的设定。这些参数直接决定DNA双链解链、引物退火、链延伸以及荧光信号采集的质量。QuantStudio 3在硬件精度与软件可编程性上均达到高水平，能够兼顾标准模式与快速模式下的不同实验需求。

二、热循环系统结构与温控机制

1. Peltier半导体加热/制冷模块

QuantStudio 3采用高性能Peltier热电模块，可实现±0.25°C的温控精度。其核心由多层半导体晶片构成，电流方向改变即可实现升温或降温，反应速度快、热传导均匀。

2. 温度传感系统

模块内置多点温度探头，实时检测96孔板各区域温度，系统通过算法修正孔间差异，使温度均匀性保持在±0.3°C以内。

3. PID智能控制算法

采用比例—积分—微分控制（PID）模型，根据实际温度变化动态调整电流输出，使升降温过程平稳且快速，避免过冲或滞后。

4. 热传导材料

模块表面采用高导热铝合金与氧化涂层处理，确保与PCR板充分接触并防止腐蚀。

5. 上盖加热系统

上盖温度可独立设定，一般为105°C，用于防止反应液蒸发和冷凝。温度稳定性控制在±0.5°C以内。

三、热循环参数的基本组成

标准PCR反应的热循环程序包括三个阶段：

1. 初始变性（Initial Denaturation）

• 目的：完全解开DNA双链并激活热启动酶。

• 温度：94–95°C

• 时间：30秒–3分钟

2. 循环扩增阶段（Amplification Cycles）
   每个循环包括以下三个步骤：

• 变性（Denaturation）：94–95°C，持续10–15秒，使DNA再次解链；

• 退火（Annealing）：55–65°C，持续20–30秒，使引物与模板结合；

• 延伸（Extension）：72°C，持续20–40秒，Taq酶延伸新链。
  通常进行35–45个循环。

3. 最终延伸（Final Extension）

• 温度：72°C

• 时间：5–10分钟
  用于确保所有产物完全延伸。

在实时荧光定量PCR中，退火和延伸阶段往往合并为一个温度步骤（如60°C），并在该阶段实时采集荧光信号。

四、QuantStudio 3的热循环参数设置

在QuantStudio 3的操作界面中，用户可通过“Thermal Profile”模块自由编辑反应程序。

1. 温度设定

系统支持0.1°C的步进精度，可在40–100°C范围内任意设置。不同阶段温度可单独调整，并支持阶梯式升降温设置。

2. 时间设定

时间单位精确到0.1秒，允许用户在快速PCR中缩短变性或退火时间而不影响扩增效率。

3. 循环次数

默认40个循环，最大可设置至100循环，以适应极低拷贝模板的检测需求。

4. 信号采集点

可在退火或延伸阶段启用荧光信号采集。对于SYBR Green法，一般在60°C阶段采集；对于TaqMan探针法，则在延伸阶段采集。

5. 熔解曲线分析

SYBR Green体系下，程序可在扩增结束后设置熔解曲线阶段：

• 起始温度：60°C

• 终止温度：95°C

• 升温速率：0.3°C/秒

• 采集模式：连续荧光监测

五、标准模式与快速模式参数比较

快速模式依托QuantStudio 3高效的热传导性能和优化的Fast Master Mix反应体系，可在保证结果准确性的前提下显著缩短实验时间。

六、升降温速率与温度均匀性

1. 升温速率

QuantStudio 3的升温速率可达4.25°C/秒，适合快速反应体系；标准反应下约为3°C/秒。

2. 降温速率

降温速率可达3.6°C/秒，保证温度过渡平滑，防止非特异性扩增。

3. 温度均匀性

在95°C阶段，孔间温差不超过±0.3°C；在60°C阶段，均匀性保持在±0.2°C以内。

4. 稳定性

长期运行后温度偏差不超过±0.25°C，保证数据重复性。

七、常见热循环程序类型

1. 两步法PCR程序（2-step PCR）

最常用于TaqMan探针体系。

mathematica复制编辑95°C  → 60°C（变性/退火延伸合并）

特点：程序简单，信号采集稳定，适合基因表达分析。

2. 三步法PCR程序（3-step PCR）

用于SYBR Green体系或特异性要求高的实验。

mathematica复制编辑95°C（变性） → 60°C（退火） → 72°C（延伸）

特点：控制灵活，适合多种模板。

3. 熔解曲线模式（Melt Curve Mode）

用于SYBR Green实验后期特异性验证。系统自动绘制温度—荧光导数曲线，以区分特异性扩增和引物二聚体。

4. Touchdown PCR程序

退火温度逐步下降以提高特异性。例如：

mathematica复制编辑95°C → 65°C（退火，递减1°C/循环至55°C） → 72°C

适合复杂模板或引物设计不理想的实验。

八、热循环参数优化策略

1. 模板相关优化

• 高GC模板：增加变性时间至30秒；

• 低浓度模板：延长退火时间或增加循环数；

• RNA逆转录产物：适当降低退火温度以提高结合效率。

2. 引物退火温度优化

可通过梯度PCR功能设置55–65°C范围，确定最佳退火温度以获得单一特异性峰。

3. 延伸时间优化

产物长度不同需调整延伸时间：

• <200 bp：20秒即可；

• 200–1000 bp：30–60秒；

• 1000 bp：适当延长至90秒。

4. Mg²⁺浓度调整

提高Mg²⁺浓度可增强酶活性但降低特异性，通常1.5–3.0 mM为最佳范围。

5. 通道采集时机调整

若信号延迟，应将荧光采集时间点后移至延伸阶段末端。

九、程序编辑与保存

QuantStudio 3支持用户在软件中创建自定义程序模板。

操作流程：

1. 打开“Thermal Profile”界面；

2. 添加阶段（Stage）与步骤（Step）；

3. 设置温度、时间、循环数；

4. 勾选“Collect Fluorescence Data”；

5. 保存模板，可在后续实验中直接调用。

模板管理：

系统支持多达50个自定义热循环模板，并可通过USB或云端共享。

十、影响热循环效果的关键因素

1. PCR板与模块接触

PCR板底部应平整、贴合模块表面，否则会导致孔间温度不均。推荐使用赛默飞原厂光学透明板。

2. 反应体积

标准为20 μL，小于10 μL时温度变化更快，但蒸发风险增加。上盖温度需略高（约105°C）。

3. 蒸发与冷凝

若封膜不严或上盖温度偏低，会导致液体浓度变化，从而影响Ct值稳定。

4. 热循环次数

循环数过少影响灵敏度，过多则可能引入非特异扩增。常规为40次。

5. 程序切换过渡

过渡温度速率过快可能导致信号延迟或扩增曲线扭曲，应在特定阶段设置缓冲（hold time）。

十一、实验实例与热循环参数配置

实例一：SYBR Green基因表达检测

mathematica复制编辑阶段1：95°C 2分钟（初始变性）  
阶段2：循环40次  
  95°C 15秒（变性）  
  60°C 30秒（退火/延伸+信号采集）  
阶段3：熔解曲线  
  60°C–95°C，升温速率0.3°C/秒

结果：单一熔解峰，Ct值稳定，重复性优于0.2。

实例二：TaqMan探针法病毒检测

mathematica复制编辑阶段1：95°C 20秒  
阶段2：循环40次  
  95°C 1秒  
  60°C 20秒（信号采集）

结果：检测限1 copy/μL，扩增效率98%，R²=0.999。

实例三：Touchdown程序

mathematica复制编辑阶段1：95°C 2分钟  
阶段2：循环40次  
  95°C 15秒  
  65°C–55°C递减退火1°C/循环  
  72°C 30秒  
阶段3：72°C 5分钟

结果：显著提高特异性，消除非特异扩增峰。

十二、热循环性能验证

1. 温度精度测试

使用标准温度验证板检测模块在不同阶段的温度偏差，结果应≤±0.25°C。

2. 孔间一致性

以同一体系运行96孔板，Ct值差异不超过±0.3，说明热循环一致性良好。

3. 长期稳定性

连续运行100次循环后，温度偏差不超过±0.3°C，表明系统稳定。

4. 数据重复性

相同样品多次检测Ct值标准差<0.2，证明热循环参数稳定可靠。

十三、常见问题与排查

十四、维护与校准建议

1. 温控模块校准：每6个月执行一次Thermal Verification；

2. 上盖压力检查：确保均匀接触反应板；

3. 风道清洁：防止散热不均影响温度稳定；

4. 环境监测：实验室温度保持20–25°C，湿度<70%；

5. 更新固件：定期通过Thermo Fisher Cloud更新控制算法