一、扩增程序的基本原理

实时荧光定量PCR的扩增程序基于聚合酶链式反应（PCR）的热循环原理。DNA通过反复的高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段实现指数级复制。QuantStudio 3的扩增程序通过精准控制每个温度阶段的时间与温度曲线，并在指定阶段实时采集荧光信号，实现DNA定量分析。

其基本反应过程如下：

1. 变性（Denaturation）：在94–95℃高温下使DNA双链解链为单链，暴露出模板序列；

2. 退火（Annealing）：在55–65℃下，引物与互补模板结合形成引物-模板复合物；

3. 延伸（Extension）：在Taq酶最适温度（通常为72℃）下，沿模板合成新的DNA链；

4. 荧光检测（Fluorescence Acquisition）：在延伸阶段或退火阶段实时记录荧光信号强度，用于绘制扩增曲线。

每个循环均重复上述过程，通过荧光信号与循环次数（Ct值）的关系反推出模板初始浓度。

二、QuantStudio 3扩增程序的结构组成

QuantStudio 3的扩增程序由多个阶段（Stage）组成，每个阶段可包含一个或多个步骤（Step），每个步骤可独立设定温度、保持时间和荧光采集点。其典型结构如下：

其中，扩增循环阶段是最关键部分，可采用“三步法”或“两步法”。

三、三步法与两步法扩增程序

1. 三步法（Three-step PCR）

三步法包括变性、退火、延伸三个独立阶段。
适用场景：传统Taq酶体系、长片段扩增、复杂模板或低GC含量序列。
示例程序：

• 95℃ 15 s（变性）

• 60℃ 30 s（退火）

• 72℃ 30 s（延伸）

荧光信号通常在延伸阶段采集。三步法的优点是灵活，可独立优化每个阶段温度，缺点是循环时间略长。

2. 两步法（Two-step PCR）

两步法将退火与延伸阶段合并，常用于高性能聚合酶和短片段扩增。
示例程序：

• 95℃ 15 s（变性）

• 60℃ 60 s（退火/延伸）

此法简化了程序结构，提高效率，适合SYBR Green体系与TaqMan探针体系。

四、QuantStudio 3扩增程序的设置方法

1. 打开实验模板

在Design & Analysis软件中选择实验类型（例如标准曲线、ΔΔCt、SNP分型等）。

2. 进入Thermal Profile编辑界面

选择“Thermal Cycler Program”选项卡，在图形化界面中编辑扩增阶段。

3. 设置各阶段参数

• 初始变性：95℃，时间1–3分钟。

• 循环次数：40次为标准，可根据样品浓度调整。

• 变性步骤：95℃，15秒。

• 退火/延伸：根据引物Tm值选择58–62℃，保持30–60秒。

• 荧光采集点：设置在延伸阶段。

4. 设置熔解曲线

在SYBR Green体系中启用“Dissociation Stage”，升温速率0.1–0.3℃/s，检测单一峰以确认特异性。

5. 保存与运行

点击“Save Program”保存为模板（.edt文件），可重复调用。

五、程序参数设计原则

1. 退火温度与引物Tm匹配
   退火温度一般低于引物Tm 3–5℃，温度过低易导致非特异性扩增，过高则效率降低。

2. 延伸时间与片段长度匹配
   每kb DNA片段推荐延伸时间1分钟。短片段（100–200 bp）可设30秒。

3. 循环次数确定
   一般设35–40个循环。模板浓度较低时可增加至45，但过多循环会引入假阳性信号。

4. 温度升降速率
   QuantStudio 3支持4℃/s升降速率，通常保持1–2℃/s以保证反应稳定。

5. 荧光采集阶段
   在TaqMan体系中选择延伸阶段采集；在SYBR Green体系中可选择退火阶段，以减少背景。

六、扩增程序的优化策略

1. 退火温度梯度优化
   利用QuantStudio 3的温度梯度功能，在56–66℃范围内筛选最佳退火温度，以获得最低Ct和单一熔解峰。

2. Mg²⁺浓度优化
   Mg²⁺影响Taq酶活性与引物结合。通过逐步调整浓度（1.5–3.0 mM）优化扩增效率。

3. 循环数优化
   确定扩增曲线稳定区间，防止过多循环引起平台效应。

4. 时间优化
   缩短非关键步骤时间，提高通量；但关键阶段时间不可过短，以防信号不稳定。

5. 模板与引物浓度平衡
   适当降低模板浓度可减少背景荧光，提高扩增曲线清晰度。

七、QuantStudio 3扩增程序的技术特点

1. 高精度温控系统
   温度均一性≤±0.25℃，保证每个孔扩增条件一致，Ct值偏差小于0.2。

2. 多通道实时采集
   支持FAM、VIC、ROX、CY5等四通道荧光同步检测。

3. 自动化程序控制
   软件可自动计算退火温度、设置采集点并优化升温速率。

4. 智能化曲线拟合
   在扩增阶段自动进行基线扣除与阈值计算，实时绘制扩增曲线。

5. 梯度温控模式
   允许设置多个温区，适合新引物筛选与条件优化。

6. 快速PCR模式
   升温速率达4℃/s，能在40分钟内完成全程扩增。

八、不同化学体系下的扩增程序示例

1. SYBR Green体系

2. TaqMan探针体系

3. 高GC模板扩增体系

4. RT-qPCR（反转录定量PCR）

九、扩增程序与荧光信号采集的关系

QuantStudio 3在扩增程序中通过时间分辨采集荧光信号，记录每个循环的实时变化。

1. 采集阶段选择：

• SYBR体系多在退火阶段；

• TaqMan体系多在延伸阶段。

2. 荧光采集频率：
   每个循环采集一次信号，系统自动保存至荧光数据矩阵。

3. 信号基线设定：
   软件在初始循环中建立基线范围（如Cycle 3–15），后续信号与基线差异用于绘制扩增曲线。

4. 阈值自动计算：
   QuantStudio 3采用动态阈值算法，根据荧光斜率自动定位Ct点。

十、扩增程序性能评估指标

1. 扩增效率（E）
   计算公式：E = (10^(-1/slope) - 1) × 100%。理想范围90–110%。

2. 相关系数（R²）
   反映Ct值与模板浓度的线性关系，应≥0.99。

3. 重复性（SD）
   三重复孔Ct值标准差应<0.3。

4. 特异性验证
   熔解曲线单一峰表明扩增产物特异性良好。

5. 信号稳定性
   扩增曲线应呈典型的“S形”，基线平稳，无波动。

十一、扩增程序常见问题及解决方法

十二、扩增程序的优化与验证

在正式实验前，应通过验证实验优化扩增程序。

1. 温度梯度法：筛选最佳退火温度。

2. 标准曲线法：利用梯度稀释样品建立标准曲线，评估效率。

3. 重复性验证：重复3次实验，Ct标准差<0.3。

4. 熔解分析法：确认扩增产物单一性。

通过这些方法可确保扩增程序具有高灵敏度和高特异性。

十三、扩增程序与实验类型的匹配

1. 基因表达分析
   采用两步法扩增程序，快速高效；选择60℃退火温度；采集阶段设为延伸。

2. 拷贝数检测
   建议使用三步法，以提高线性范围与扩增稳定性。

3. 病原体定量
   程序应包含标准曲线阶段与多通道采集，以实现多靶标同步检测。

4. 基因分型
   扩增程序结合解链曲线分析阶段，用于判定基因型。

十四、扩增程序的质量控制与维护

1. 定期执行温控校准：保证升降温精度；

2. 检查反应板密封性：防止蒸发影响温度均一；

3. 更新软件版本：保持算法与数据处理最新；

4. 维护仪器环境：保持通风与恒温，减少温度漂移；

5. 记录与存档扩增程序模板：便于重复使用与追溯。