一、系统概述

QuantStudio 3实时荧光定量PCR仪是Thermo Fisher Scientific推出的中通量实时定量检测系统，支持多重荧光信号采集与分析。该设备配备4通道光学检测系统，可在单次反应中同时监测多个荧光信号，实现多靶标、多基因和多样品的同步检测。

荧光通道是QuantStudio 3实现高灵敏检测与多重分析的核心部分。通过精密光源、滤光片和检测器的协同工作，仪器可将不同波长的荧光信号准确区分并量化，为定量PCR反应提供实时数据支撑。

二、光学系统总体构成

QuantStudio 3的光学系统采用垂直光路结构设计，光线自上而下穿过反应孔底部，实现高效激发与采集。光学模块由以下主要部分组成：

1. 多波段LED激发光源
   提供高强度、宽光谱的稳定激发光，波动性小于±1%。

2. 激发滤光片组
   用于选择特定波段光线，确保各荧光染料在最佳激发波长下获得最大信号。

3. 反射镜组与光路准直系统
   调整光路方向和光束强度，使光线均匀照射反应板。

4. 发射滤光片组
   用于筛选各染料特定波长的发射光，避免不同通道间信号重叠。

5. 高灵敏CMOS检测器
   实时记录荧光信号强度变化，精度可达12-bit分辨率，信噪比超过10,000:1。

6. 光学通道切换系统
   自动控制LED与滤片组切换，以极短时间完成通道转换，保证多通道同步采集的时间一致性。

三、荧光通道配置与波长参数

QuantStudio 3的4个荧光通道涵盖从绿色到远红色的光谱范围，可同时检测多种常用荧光染料。其典型配置如下表所示：

每个通道都具备独立的激发滤光片和发射滤光片组合，以最大程度降低光谱串扰。

四、通道光谱特性与性能指标

1. 光谱分辨率

QuantStudio 3的光学滤片设计确保通道间光谱间隔不小于30 nm，有效防止不同染料之间信号交叉。光谱重叠控制在1.5%以内，满足多重荧光实验需求。

2. 光学灵敏度

• 单拷贝模板检测可在FAM通道实现；

• ROX通道信号波动控制在±2%；

• 信号线性范围覆盖9个数量级（10¹–10⁹ copies）。

3. 动态检测范围

在四通道同时检测模式下，QuantStudio 3仍能保持高线性响应。标准曲线R²值≥0.999，扩增效率维持在90–110%。

4. 通道均一性

四通道光学响应均匀性偏差小于±2%，通道灵敏度间差异通过系统校准自动补偿。

五、常用荧光染料与通道匹配

1. 单染料体系（Singleplex）

单一染料检测适用于标准曲线法或相对定量分析。

2. 多重荧光体系（Multiplex）

在多靶标检测中，应选用光谱差异较大的染料组合。常见搭配方案：

• 双重体系：FAM + VIC；

• 三重体系：FAM + VIC + Cy5；

• 四重体系：FAM + VIC + ROX + Cy5。

每个染料对应通道需在“Plate Setup”界面中正确配置，以确保信号识别。

六、通道校准与补偿机制

QuantStudio 3在出厂时已完成标准光学校准，但为保证长期稳定性，用户可通过软件执行定期校正。

1. 光学校准（Optical Calibration）

在“Maintenance”菜单中选择“Optical Calibration”功能。系统会：

• 激发各通道标准板内的已知荧光溶液；

• 测量通道响应并与标准曲线比对；

• 自动调整增益和亮度补偿。

校准完成后生成报告文件，标明各通道灵敏度与信号偏差。

2. 光谱补偿（Spectral Compensation）

在多重PCR中，若荧光光谱有重叠，系统会使用光谱矩阵算法解卷积各通道信号。补偿过程包括：

• 建立各染料的单通道光谱模板；

• 计算通道间干扰系数；

• 自动修正多重检测信号。

该功能确保多染料体系下的定量准确性。

七、通道间差异与交叉验证

尽管QuantStudio 3的通道设计高度稳定，但在长期使用或不同批次滤片间，仍可能存在细微差异。为确保结果一致性，应进行交叉验证。

1. 光谱漂移检查

使用标准荧光板测试四通道峰值波长，如偏差超过±5 nm，则需执行光学校准。

2. 信号强度对比

在相同染料条件下运行多孔样品，若通道间信号强度差异大于5%，可通过调整探针浓度或重新校准解决。

3. 背景信号评估

定期检测空白反应的背景荧光值（Rn baseline），各通道应维持在同一数量级。若差异明显，需清洁光学窗口或更换封膜。

八、通道配置在不同实验类型中的应用

1. SYBR Green定量检测

仅需使用FAM通道采集信号。系统支持熔解曲线分析，可区分非特异产物。

2. TaqMan探针法

TaqMan法多用于多重检测实验。

• FAM通道：检测主靶标；

• VIC通道：检测内参或次要靶标；

• ROX通道：作为参考染料；

• Cy5通道：用于稀有突变或第三基因检测。

3. 基因分型实验（SNP分析）

常用FAM/VIC双染体系，通过荧光散点图区分等位基因型。系统自动生成基因型判定图（Cluster Plot）。

4. 融解曲线分析

在SYBR Green体系中，FAM通道记录升温过程中荧光变化，用于判断扩增产物特异性。

5. 病原体多重检测

四通道配置允许在单管中检测多种病原体，如细菌、病毒或转基因成分，实现高效筛查。

九、通道优化策略

为提高检测准确性与通道独立性，需在实验设计阶段进行优化。

1. 染料选择原则

• 光谱区分度大，避免激发与发射波长过近；

• 发光效率高，信号稳定；

• 与反应体系兼容性好（不干扰酶反应）。

2. 通道强度平衡

当不同通道信号差异较大时，可通过以下方式平衡：

• 提高低信号通道探针浓度（0.1→0.2 μM）；

• 调整通道增益参数；

• 选择强度相匹配的荧光染料。

3. 通道污染防控

防止样品气溶胶或试剂溅射污染光学窗口。每次实验结束后应用无水乙醇清洁通道区域。

十、通道检测性能验证

QuantStudio 3出厂前均通过性能验证，用户也可自行进行周期性检测。

1. 标准板测试

使用Thermo Fisher官方校准板（Optical Calibration Plate），检测通道灵敏度、线性及信噪比。

2. 实验验证

以梯度稀释模板进行多通道实验，绘制标准曲线并计算各通道扩增效率。
结果判定标准：

• Ct值重复性SD ≤ 0.2；

• R² ≥ 0.99；

• 扩增效率在90–110%范围。

十一、通道稳定性与维护

1. 光学窗口清洁

长期使用后，通道窗口可能因粉尘或蒸汽污染导致信号衰减。应定期用无尘布蘸乙醇清洁。

2. 环境控制

保持仪器在20–25°C、湿度40–70%的实验室环境中，防止光学器件受潮。

3. 校准周期

建议每3–6个月执行一次光学校准，特别是在高频使用或更换荧光染料类型后。

4. 通道寿命

LED光源寿命可达10万小时，滤光片抗老化处理，长期使用性能稳定。

十二、通道数据处理与软件支持

QuantStudio 3配套软件具备通道自动识别与数据管理功能。

1. 自动通道识别

在“Plate Setup”界面中设置染料类型后，系统会自动匹配对应通道，无需人工分配。

2. 光谱解卷积算法

多重实验中，软件通过矩阵算法分离各通道信号，减少串扰。

3. 通道可视化

在“Results”界面中，可单独查看各通道扩增曲线、荧光强度分布及Ct值表格。

4. 信号标准化

ROX通道常作为内参，软件会自动校正因加样或体系差异引起的荧光波动，输出标准化数据。

十三、典型通道应用案例

1. 三重检测体系（FAM/VIC/Cy5）

• FAM：检测目标基因；

• VIC：检测内参基因；

• Cy5：检测稀有突变位点。
  系统通过三通道同步采集信号，实现三基因定量。

2. 四重TaqMan检测

在病原体筛查实验中，使用FAM/VIC/ROX/Cy5四通道组合，可在单管中检测四种病毒基因，Ct值差异不超过0.3。

3. 荧光稳定性验证

在长时间运行中测试四通道信号稳定性，结果显示24小时后信号强度变化小于±1.5%，证明光学系统长期稳定。

十四、荧光通道配置的优势

1. 高兼容性
   支持市售主流荧光染料，兼容TaqMan、SYBR Green、MGB等体系。

2. 低串扰设计
   滤光片组合优化，确保多重检测中信号纯净度高。

3. 光强自动校正
   系统实时监测LED输出强度并自动补偿。

4. 扩展性强
   支持用户自定义染料设置，可根据新型探针扩展通道配置。

5. 通道同步采集
   所有通道同时采集信号，避免时间偏移影响定量结果。