一、校验的重要性概述

QuantStudio 3实时荧光定量PCR仪是赛默飞公司推出的中通量核酸扩增检测设备，其性能依赖于温控模块、光学检测系统与机械组件的高精度协同。经过长期使用或多次运行后，系统可能因热循环疲劳、光学组件老化、环境条件变化或操作误差而出现偏差。
为了保证实验数据的准确性与可重复性，必须定期执行校验（Calibration）与验证（Verification）操作。

校验的核心目的包括：

1. 确认仪器温度控制的准确性与孔间均一性。

2. 确保光学检测通道的响应灵敏度与线性。

3. 验证机械模块（如上盖、板架、压合系统）的定位精度。

4. 检查软件算法的计算一致性。

通常建议用户每3个月进行一次例行校验，若设备连续运行频繁或用于临床检测，应每月执行一次完整流程。

二、QuantStudio 3系统校验类型

QuantStudio 3校验主要包括五个部分：

1. 温度校验（Thermal Calibration）

2. 光学校验（Optical Calibration）

3. 通道光谱校准（Dye Calibration）

4. 机械系统检测（Mechanical Verification）

5. 软件功能验证（Software Validation）

各项校验相互独立又相互关联，共同构成仪器性能验证体系。

三、校验前准备

1. 环境条件要求

• 实验室温度保持在20–25°C；

• 相对湿度控制在40%–70%；

• 避免阳光直射或强电磁干扰；

• 仪器放置在稳固平面上，无震动或强气流。

2. 仪器状态检查

• 确认QuantStudio 3已关闭前一次运行程序；

• 温控模块冷却至室温；

• 光学窗口干净无灰尘、水汽；

• 板架及压盖无异物残留。

3. 所需材料

• 赛默飞原厂校准板（Calibration Plate）；

• 温度校验传感探头套件；

• 校准软件文件（由Thermo Fisher Cloud或本地软件调用）；

• 无尘布、无水乙醇用于清洁；

• USB连接线或局域网连接。

四、温度校验流程

温度校验旨在确保PCR热循环模块的升温速率、降温速率及温度精度符合设计标准。

1. 校验原理

QuantStudio 3采用Peltier加热模块进行热循环。温控精度依赖于模块的热响应及反馈系统。校验时通过温度传感器实时记录各孔位温度，并与标准温度曲线比对，以验证模块准确性。

2. 操作步骤

（1）安装温度探头板
将温度探头校准板放置在样品槽中，确保与模块平贴。连接探头数据线至仪器接口。

（2）启动校准程序
在软件主界面选择：
Instrument → Maintenance → Thermal Calibration。
系统自动识别探头板型号并提示校验步骤。

（3）执行温控循环
程序将依次运行多段加热与冷却曲线，记录模块温度与标准值偏差。每个循环约需20分钟。

（4）生成校准报告
软件自动计算平均偏差、孔间温差及温度线性。若偏差≤±0.25°C且孔间差≤0.3°C，则判定为合格。

（5）保存与更新数据
系统保存校准参数并更新至温控控制模块。若误差超限，仪器将提示“Recalibration Required”。

五、光学校验流程

光学校验用于验证激发光源、滤光系统及检测器的工作稳定性与灵敏度。

1. 校验原理

QuantStudio 3通过多波段LED光源激发荧光，并由CMOS探测器检测不同波长信号。校验时使用含已知荧光强度的标准板，通过比对理论值与实测值判断系统灵敏度与线性。

2. 操作步骤

（1）清洁检测窗
用无尘布蘸无水乙醇擦拭光学窗，保持清洁。

（2）放置光学校准板
将荧光标准板放置于模块中央，方向与A1孔一致。

（3）执行程序
在软件中选择：
Instrument → Maintenance → Optical Calibration。
系统将依次激发各通道（FAM、VIC、ROX、Cy5），检测标准信号强度。

（4）自动分析
软件生成光谱响应曲线与通道灵敏度数据。若各通道信噪比（S/N）>10000且通道偏差<2%，则通过校验。

（5）光源补偿
若某通道衰减明显，系统自动进行亮度补偿或提示更换LED组件。

六、通道光谱校准流程（Dye Calibration）

通道光谱校准用于建立不同荧光染料在各通道的光谱识别矩阵，确保多重检测时信号准确分离。

1. 校验原理

不同荧光染料（如FAM、VIC、ROX、Cy5）具有独特激发与发射光谱。校准通过测定每种染料在通道内的响应曲线，生成光谱解卷积矩阵，以便系统在多通道实验中准确区分信号。

2. 操作步骤

（1）准备染料校准板
板内含多种纯染料溶液，分别放置于指定孔位。

（2）运行校准程序
选择：
Instrument → Maintenance → Dye Calibration。
系统逐个激发检测，获取各染料发射曲线。

（3）生成光谱模板
软件拟合各染料光谱分布并存储为标准模板文件。

（4）验证通道分离度
系统计算通道间交叉干扰（Cross-talk）比例，应低于1.5%。若超限，需重新执行校准或更换滤光片。

（5）保存结果
校准数据存储在系统内存及软件数据库中，用于后续实验自动补偿。

七、机械系统校验

机械系统校验用于验证上盖、板架及压合结构的定位精度与机械压力。

1. 上盖压合检测

• 在软件选择“Lid Verification”功能；

• 系统检测上盖是否能完全闭合、压力传感器是否达到设定值；

• 若提示“Pressure Low”，检查压合弹簧是否老化或更换密封圈。

2. 板架定位检测

• 放置标准96孔测试板；

• 执行“Plate Alignment Test”；

• 系统分析光学中心点是否与样品孔位重合，偏差应≤0.2 mm。

3. 导轨与运动平滑性检测

• 通过软件启动“Mechanical Test”，仪器自动上下移动压盖与板架；

• 若检测到卡滞或异响，需润滑导轨或更换机械组件。

八、软件验证流程

软件验证确保数据分析算法与用户界面正常运行。

1. 系统自检

在主界面选择“System Diagnostics”，仪器将自动检查：

• 驱动程序完整性；

• 通信接口；

• 数据缓存与存储空间；

• 版本兼容性。

2. Ct计算验证

使用标准模板文件运行模拟实验，比较Ct计算结果与历史参考数据。偏差应小于0.2个循环。

3. 网络与数据传输验证

若使用Thermo Fisher Cloud平台，需测试：

• 云端同步速度；

• 数据上传完整性；

• 报告自动生成功能是否正常。

九、周期性维护与校验频率

若仪器长时间未使用（>1个月），建议重新执行温控与光学校准。

十、校验结果分析与判定标准

1. 温度校验判定

• 模块平均偏差：≤±0.25°C；

• 孔间温差：≤0.3°C；

• 升温速率：≥4°C/s；

• 降温速率：≥3.5°C/s。

若超出范围，应执行重新校准或更换加热模块。

2. 光学校验判定

• 信噪比（S/N）：≥10000；

• 通道响应偏差：≤2%；

• 通道间串扰：≤1.5%；

• 线性相关系数（R²）：≥0.999。

若通道灵敏度下降>10%，应检查LED光源及滤片清洁度。

3. 机械校验判定

• 上盖压力值：80–100 N；

• 板架偏移量：≤0.2 mm；

• 导轨运动平滑度：无卡滞或异常噪声。

十一、常见校验问题与解决

十二、校验记录与质量管理

QuantStudio 3在每次校验后会生成自动报告，包含：

• 校验项目名称与执行日期；

• 操作人员姓名；

• 校验参数与合格判定；

• 仪器序列号与软件版本；

• 图表数据（温度曲线、光谱曲线、通道响应等）。

建议实验室建立校验档案，保存报告电子版及打印件，以备质量体系审查。对于临床实验室，应符合ISO 15189和GMP规范的设备验证要求。

十三、校验后的系统优化

校验完成后，QuantStudio 3会自动重启并加载最新参数。用户应执行以下步骤以保证性能：

1. 运行空载程序，确认模块升降温曲线平滑；

2. 执行标准样品检测，验证Ct值一致性；

3. 若发现微小偏差，可通过“Fine Tune”功能调整温度补偿；

4. 更新实验模板文件，确保参数引用最新校准数据。

十四、延长校准周期的建议

• 保持仪器清洁、避免液体渗漏；

• 实验结束后保持上盖关闭，防止灰尘进入光学区；

• 使用原厂PCR板和封膜，减少机械误差；

• 定期清洁风口与内部风道，防止过热；

• 避免频繁开关电源，延长LED寿命。

良好的日常维护可延长校准周期并降低故障风险。