赛默飞荧光定量PCR仪QuantStudio 3样品准备
一、样品准备的总体原则
样品制备是PCR实验中最基础也最关键的环节。无论目标为DNA、RNA还是cDNA，以下基本原则应贯穿整个过程：
避免污染：PCR是一种极高灵敏度的扩增技术，任何微量外源核酸都可能造成假阳性。应将样品制备区与扩增检测区严格分离，并使用专用移液器与吸头。
保持纯度与完整性：模板中若含有蛋白质、盐类、酚类或乙醇残留，会抑制聚合酶活性。提取后需进行纯度检测并确保A260/A280比值在1.8–2.0之间。
确保浓度合适：模板浓度应在检测线性范围内，过低导致信号延迟，过高可能造成非特异性扩增。
防止降解：RNA样品极易被RNA酶降解，应在低温、无RNA酶环境中操作并使用RNA保护剂。
二、样品采集与保存
1. 样品类型
QuantStudio 3可检测的样品类型非常广泛，包括动物组织、植物组织、细胞、血液、唾液、细菌、真菌、病毒、血清及临床拭子等。不同样品类型需选择合适的核酸提取方法。
2. 采集原则
使用无核酸酶污染的采样管；
样品采集后应立即冷冻保存；
对RNA样品应使用RNA保护液，如RNAlater，避免在常温暴露。
3. 保存条件
DNA样品可储存在 -20℃；
RNA样品应储存在 -80℃；
组织样品短期内使用可保存在4℃，长期应冷冻；
避免反复冻融，以免核酸断裂。
三、核酸提取
高质量的核酸是成功进行定量PCR的前提。提取方法应根据样品性质选择，确保核酸纯净、完整且无抑制物。
1. DNA提取
常用方法包括酚/氯仿抽提法、柱式提取法与磁珠法。
酚/氯仿法：适合高纯度研究型样品，但操作繁琐；
柱式提取法：常用于常规实验室，步骤简便、重复性好；
磁珠法：适合自动化高通量提取，可减少人工误差。
提取后使用NanoDrop测量浓度与纯度，浓度一般要求10–100 ng/μL，A260/A280比值为1.8–2.0。
2. RNA提取
RNA需严格避免酶污染。常用方法有TRIzol法、柱式法和磁珠法。
TRIzol法可有效裂解细胞并保护RNA，但操作中应避免接触酚层；
柱式法速度快、适合RNA纯度要求高的实验。
RNA纯度要求更严格，A260/A280应在1.9–2.1之间，完整性通过琼脂糖电泳或生物分析仪验证，28S:18S比约为2:1。
3. cDNA合成
对于基因表达研究，RNA需反转录为cDNA。使用高质量反转录试剂盒，反应体系一般包括反转录酶、随机引物或Oligo(dT)引物、dNTP混合液和RNA模板。反转录反应通常设为42℃ 30分钟，随后加热终止酶活。所得cDNA可直接用作QuantStudio 3模板。
四、样品质量检测与评估
1. 吸光度法检测纯度
利用分光光度计测定A260、A280、A230值：
A260/A280 ≈ 1.8–2.0：说明纯度良好；
A260/A230 ≥ 2.0：说明无酚或盐污染；
若偏低，需重新纯化。
2. 荧光法检测浓度
使用Qubit等荧光定量仪，灵敏度高于吸光度法，适合低浓度样品。
3. 完整性检测
RNA样品可通过电泳或Agilent Bioanalyzer检测。完整RNA应显示清晰的28S与18S条带。
五、模板稀释与储存
为确保扩增效率一致，应对模板进行稀释。
DNA样品一般稀释至10–50 ng/μL；
cDNA样品稀释比例为1:5或1:10；
RNA样品在反转录前可根据目标基因丰度调整至100–1000 ng。
稀释时使用无RNA酶水或TE缓冲液，避免反复冻融。稀释后的模板应在冰上使用，未使用完的部分应立即冷冻保存。
六、反应体系配置
QuantStudio 3推荐使用标准20 μL或25 μL反应体系，常见配置如下（以20 μL为例）：
2× qPCR Master Mix：10 μL
Forward Primer（10 μM）：0.5 μL
Reverse Primer（10 μM）：0.5 μL
模板DNA/cDNA：1–2 μL
无RNA酶水补足至20 μL
若使用TaqMan探针体系，需额外加入0.25 μL探针。模板体积不宜超过体系的10%，否则可能抑制扩增。
七、引物与探针准备
1. 引物设计要求
长度为18–24个碱基；
GC含量为40%–60%；
扩增产物长度控制在80–200 bp；
避免形成二聚体或发夹结构。
2. 探针选择
TaqMan探针由报告荧光基团和淬灭基团组成。常用报告基团包括FAM、VIC、ROX等，应与仪器光学通道相匹配。
3. 引物储存与稀释
母液浓度为100 μM，工作液浓度为10 μM，低温避光保存，避免多次冻融。
八、反应板与样品加样
1. 板型选择
QuantStudio 3支持0.1 mL与0.2 mL 96孔板。应使用配套的光学透明板，以确保信号传递。
2. 加样操作
加样前轻轻离心混合体系；
使用滤芯吸头防止气溶胶污染；
每个样品至少设置三次重复；
设置阴性对照（NTC）与阳性对照。
加样时避免气泡进入反应体系，必要时可轻轻离心孔板。
3. 封膜
使用光学透明膜密封反应板，确保贴合无皱褶。封膜不紧会造成蒸发损失，影响荧光采集。
九、样品布局与记录
QuantStudio 3软件提供“Plate Setup”功能用于样品信息录入。
录入样品名称、目标基因、内参基因及荧光通道；
对标准、未知样品、阴性对照进行分类标记；
检查布局与加样顺序一致，防止混淆。
样品布局合理性直接影响数据处理效率。
十、反应前检查
在正式运行前，需确认以下项目：
反应体系体积准确；
无气泡、无污染；
光学膜紧密贴合；
模板与引物均匀混合；
记录完整，确保样品信息与孔位一致。
十一、运行与实时监控
将准备好的样品板放入QuantStudio 3样品仓中，确保定位正确。选择相应实验模板（绝对定量、相对定量或熔解曲线分析）。
启动程序后可实时监测荧光信号；
若某孔信号异常，可暂停检测以排查问题。
系统自动采集荧光数据并生成扩增曲线。
十二、常见问题与对策
无扩增信号
可能因模板降解、加样错误或酶失活。应重新检测模板质量。Ct值偏高
模板浓度过低或引物设计不当。可适当增加模板量或优化退火温度。重复孔差异大
说明移液不均或气泡干扰，应使用电动移液器并保证混匀。非特异扩增
可能由引物二聚体或污染引起。可通过熔解曲线分析排查。
十三、样品保存与复测
实验结束后，剩余样品应立即冷冻保存。
DNA样品：-20℃长期储存；
RNA样品：-80℃保存并尽快反转录；
cDNA样品：可在-20℃保存数月。
为确保复测数据一致，应记录模板浓度、批次和稀释倍数。
十四、质量控制与标准化
为保证样品准备的一致性，应建立标准操作流程（SOP）：
每批样品需设置内部质控（QC）模板；
不同批次模板的Ct差值不得超过0.5；
样品制备区每日清洁，防止气溶胶残留；
定期校准移液器和离心机。
标准化的样品准备流程能有效降低实验波动，确保结果可追溯。
