一、模板浓度在定量PCR中的重要性

在荧光定量PCR中，模板浓度决定了反应起始拷贝数，而Ct值（循环阈值）与初始模板量呈负对数关系。理论上，当模板浓度每降低10倍，Ct值将延长约3.3个循环。因此，模板浓度不仅影响荧光信号的检测时间，还决定了扩增曲线的形态与标准曲线的线性范围。

若模板浓度过高，可能造成体系中引物或酶耗尽过快，出现荧光信号饱和，影响Ct值判断；若模板浓度过低，荧光信号延迟甚至检测不到，导致假阴性结果。不同类型的模板（基因组DNA、cDNA、质粒DNA或病毒RNA）对浓度要求存在差异，需要根据实验目的进行合理设置。

二、模板类型与浓度范围

1. 基因组DNA模板

基因组DNA常用于拷贝数分析或突变检测，其纯度与完整性直接影响扩增效率。推荐浓度范围为1–50 ng/μL。

• 拷贝数变异检测：每孔使用5–10 ng DNA；

• 基因分型实验：每孔使用10–20 ng DNA；

• 复杂基因组（如植物或真菌）：可适当增加至30–50 ng。

浓度过高时，DNA链可能形成二聚体或影响酶活，导致曲线非线性；浓度过低时，重复性下降。

2. cDNA模板

cDNA常用于基因表达定量分析，是由反转录获得的RNA拷贝。其浓度需根据RNA输入量和反转录体系体积换算。

• 推荐cDNA浓度范围为10–100 ng/μL；

• 每孔使用1–2 μL cDNA作为模板；

• 若研究低表达基因，可适当提高输入量，但不宜超过5 μL。

cDNA浓度过高会导致非特异扩增，特别是使用SYBR Green染料时易出现假阳性峰。

3. 质粒DNA模板

用于绝对定量标准曲线的质粒模板要求准确稀释，浓度通常以拷贝数表示。

• 推荐范围：10¹–10⁸ copies/μL；

• 每级稀释梯度差为10倍；

• 扩增线性范围应覆盖所有未知样本。

标准曲线的相关系数R²应≥0.99，说明模板浓度梯度设置合理。

4. 病毒或RNA模板

RNA模板需经反转录生成cDNA后再进行扩增。

• 推荐反转录产物浓度：1–10 ng/μL；

• 若检测低拷贝病毒（如SARS-CoV-2、HBV），可通过浓缩RNA或重复反转录提高灵敏度。

RNA模板的浓度应根据实验需求与目标基因丰度调整，避免因过度稀释造成信号延迟。

三、模板浓度测定方法

准确测量模板浓度是保证定量可靠性的第一步。QuantStudio 3通常配合外部核酸定量设备，如分光光度计、荧光定量仪或琼脂糖凝胶电泳。

1. 分光光度法（Nanodrop）
   通过测量A260吸光度计算浓度：

• DNA浓度（μg/mL）= A260 × 50 × 稀释倍数；

• RNA浓度（μg/mL）= A260 × 40 × 稀释倍数。
  A260/A280值应介于1.8–2.0之间，若偏低说明蛋白污染；A260/A230值应大于2.0，若过低则可能存在有机物残留。

1. 荧光染料法（Qubit或PicoGreen）
   该方法灵敏度更高，适合低浓度样品。使用荧光染料专门结合双链DNA或RNA，通过荧光信号计算模板量，避免了杂质干扰。

2. 琼脂糖凝胶半定量法
   适用于验证模板完整性。通过比较样品与标准DNA条带亮度，可初步估算浓度并检测降解情况。

四、模板浓度优化策略

1. 预实验优化

首次建立体系时，可设置三组不同模板量（如1 ng、10 ng、50 ng），比较Ct值与扩增曲线形态。若曲线线性良好且重复性高，则说明浓度合理。

2. 稀释策略

高浓度模板需使用无RNA酶水按10倍递减稀释。推荐稀释系列为1×、10×、100×、1000×，以确定最佳浓度范围。

3. 内参基因校正

在相对定量实验中，模板输入量的差异可通过内参基因（如β-actin、GAPDH、18S rRNA）校正。确保内参Ct值稳定（波动小于0.5），可消除输入量差异对结果的影响。

4. 扩增效率验证

使用标准曲线评估不同模板浓度下的扩增效率。理想效率范围为90%–110%，斜率应在-3.6至-3.1之间。若效率偏低，需优化模板量或引物浓度。

五、模板浓度与Ct值关系

在QuantStudio 3中，Ct值与模板浓度的对数呈线性关系。以绝对定量为例：
Ct = k × log(C₀) + b
其中C₀为初始模板浓度，k为斜率。

• 当模板浓度过高，Ct值过小，曲线提前上升且平台期信号饱和；

• 当模板浓度过低，Ct值延迟甚至超过40，信号弱且基线噪声高；

• 只有在标准曲线线性范围内，Ct值与浓度关系才准确可靠。

通过标准曲线验证样品Ct值是否处于有效区间，是判断模板浓度合理与否的重要依据。

六、模板纯度对浓度的影响

模板纯度与浓度密切相关。杂质如蛋白、盐离子、酚类化合物或乙醇残留会抑制Taq酶活性，导致扩增效率下降。

1. 盐离子干扰
   高盐浓度（如NaCl、EDTA）会影响聚合酶结合效率，导致Ct值升高。模板提取后应彻底洗涤以除盐。

2. 酚类或有机溶剂残留
   若提取时使用酚/氯仿，残留会抑制反应。可通过乙醇沉淀去除。

3. RNA降解
   RNA模板降解后浓度虽高但实际有效拷贝少，应使用琼脂糖电泳或生物分析仪验证完整性。

4. DNA碎片化
   长时间储存或多次冻融会导致DNA断裂，影响扩增效率。建议模板在-20℃保存，避免反复冻融。

七、不同实验类型的模板浓度设置

1. 绝对定量实验

标准曲线模板浓度需覆盖未知样品的范围。若样品Ct值落在曲线范围外，需重新调整梯度。
例如：标准浓度设置为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³ copies/μL。

2. 相对定量实验

模板输入量应统一，不同样本间浓度差异不超过±10%。反应体系中每孔模板量控制在1–2 μL，浓度保持在10–50 ng/μL。

3. 多重检测实验

多通道体系中，模板浓度过高会造成光谱串扰。建议模板总量降低至常规体系的50%，同时保持各通道扩增效率相近。

4. 病毒载量检测

低拷贝病毒检测要求模板浓度高而背景低。可通过RNA富集或预扩增步骤提高灵敏度。检测下限可达到10 copies/反应。

八、模板浓度对扩增曲线的影响

1. 高模板浓度
   扩增曲线提前上升，Ct值偏小，平台期信号易饱和。此时标准曲线斜率偏小，导致效率虚高。

2. 低模板浓度
   曲线延迟且信号弱，噪声较大。若接近检测极限，Ct值波动大，重复性差。

3. 适宜浓度
   曲线平滑、指数期明显、Ct值稳定且重复性好。线性关系最佳，结果最具代表性。

通过比较不同浓度曲线形态，可快速判断模板输入是否合理。

九、模板浓度误差与修正

实验中常因移液误差、稀释不当或样品降解导致浓度偏差。为减少误差，可采取以下措施：

1. 使用电子移液器，减少体积误差；

2. 建立标准稀释曲线，确保浓度梯度准确；

3. 对样品浓度偏高的样本进行统一稀释，使Ct值分布一致；

4. 使用内参基因进行归一化，修正浓度波动对结果的影响。

十、浓度验证与重复性评估

QuantStudio 3可通过软件内置的重复性分析模块，计算不同样本的Ct值标准差与变异系数（CV）。若CV < 2%，说明模板浓度一致性良好。

此外，还可采用以下方法进行浓度验证：

• 标准曲线检测：R² ≥ 0.99表示模板浓度设置准确；

• 熔解曲线分析：若单一峰形表明扩增特异性良好；

• 重复实验比较：不同批次样品的Ct值差异应小于0.5。

十一、模板浓度与扩增效率的数学关系

扩增效率（E）反映PCR每个循环产物增加的倍数。其计算公式为：
E = (10^(-1/slope) - 1) × 100%
模板浓度过高或过低都会影响斜率，进而改变E值。理想情况下E = 100%，每循环扩增一倍。

若模板浓度过高，竞争效应导致E < 90%；若模板浓度过低，噪声影响E > 110%。通过调整模板浓度，使E保持在合理区间，可保证实验的线性准确性。

十二、实验优化建议

1. 模板浓度确定后，应固定输入量，避免批次差异；

2. 低表达基因实验可适当增加模板输入，但需保证反应体系不抑制；

3. 若模板浓度变化大，应重新绘制标准曲线；

4. 每批次实验应包含标准样品以监控扩增一致性；

5. 对RNA样本应进行反转录效率校验，确保cDNA产量与浓度稳定。

十三、浓度稳定性与储存条件

为维持模板浓度稳定，应注意以下事项：

• DNA样品存放于-20℃，RNA样品存放于-80℃；

• 避免反复冻融，可分装保存；

• 使用低吸附管，减少模板吸附损失；

• 定期检测模板浓度，确认无显著变化。

模板在长期储存过程中可能因降解导致有效浓度下降，需定期进行验证实验。