一、校准的意义与原理

QuantStudio 3的检测结果基于热循环系统与光学检测系统的协同工作。温度控制的稳定性决定扩增反应的效率，而光学系统的灵敏度直接影响荧光信号的准确度。随着仪器长期使用，温度传感器的响应、光源亮度以及滤光片性能可能发生微小变化，从而引入系统误差。校准的目的即是对这些偏差进行修正，确保不同时间、不同实验批次的结果具有可比性。

该仪器的校准原理主要包括两部分：

1. 温度校准（Thermal Calibration）：通过标准温度板检测加热模块在不同设定温度下的实际温度分布，修正系统控制曲线，使目标温度与实际温度一致。

2. 光学校准（Optical Calibration）：利用标准荧光板测量各通道激发与检测响应强度，校正荧光采集系统的灵敏度和线性响应范围。

通过校准，系统可自动生成新的校正曲线，应用于后续实验中，以维持数据一致性。

二、校准类型概述

QuantStudio 3的校准分为多个层面，实验室可根据使用频率和检测需求选择执行：

1. 温控模块校准（Thermal Uniformity & Accuracy Calibration）
   检验每个孔位的加热与冷却均匀性，确保温度误差小于±0.25℃。

2. 荧光通道校准（Optical Calibration）
   针对FAM、VIC、ROX、CY5等通道进行响应强度与波长匹配的校准。

3. 背景噪声校准（Background Calibration）
   校正光学系统的背景信号，消除荧光残留或反射引起的干扰。

4. 通道间一致性校准（Cross-Talk Calibration）
   修正不同通道之间的光谱串扰，提高多重检测的准确性。

5. 参考荧光校准（ROX Reference Calibration）
   在使用ROX作为被动参考染料时，用于标准化不同孔位的信号差异。

6. 系统综合校准（Full System Calibration）
   一次性执行温度与光学模块的全范围校准，建议每年或每次维护后进行。

三、校准所需材料与环境要求

在执行校准前，应准备以下材料与环境条件：

1. 专用校准板

• 温度校准板：含标准热敏电阻阵列，用于验证温度模块的准确性。

• 光学校准板：包含固定浓度的荧光参考标准，用于各通道光学响应检测。

2. 软件与驱动
   QuantStudio 3自带“Instrument Calibration Wizard”向导程序，用户可在软件中选择所需校准类型。

3. 环境条件

• 室温保持在20–25℃之间，湿度低于60%；

• 避免强光直射或电磁干扰；

• 仪器通风口保持畅通，防止热积聚。

4. 维护前准备
   在执行校准前，应确保仪器预热至少30分钟，光源达到稳定状态。

四、温度校准操作流程

1. 进入校准界面

打开主机或电脑端软件，点击“Maintenance（维护）”→“Instrument Calibration”。选择“Thermal Calibration”，系统将自动检测温控模块状态。

2. 放置温度校准板

将标准温度校准板放入样品仓，确保与加热模块紧密接触。关闭盖板后点击“Start Calibration”。

3. 自动温度检测

系统会依次设定多个温度点（如40℃、60℃、72℃、95℃），并记录实际传感器反馈。通过比较设定温度与实际温度差值，生成校正系数。

4. 结果评估

校准结束后，软件自动生成温度校正报告。若偏差小于±0.25℃，则校准通过；若超出范围，系统将提示“Recalibration Recommended”。此时应重新执行或联系技术支持。

5. 保存校正文件

点击“Apply Calibration”保存新参数，系统将在后续运行中自动应用修正曲线。

五、光学校准操作流程

光学系统校准确保不同荧光通道响应一致，避免荧光信号误差。

1. 启动光学校准程序

在软件菜单中选择“Optical Calibration”，勾选需要校准的荧光通道（如FAM、VIC、ROX、CY5）。

2. 插入光学校准板

将专用荧光校准板放入样品仓，确保位置正确，避免灰尘或指纹污染光学窗口。

3. 光学测定过程

系统依次点亮各激发光源并采集荧光信号。每个通道采集多个信号强度点，用于计算光源衰减率与探测器灵敏度。

4. 通道匹配与串扰校正

软件自动分析不同通道间信号重叠情况，并生成交叉校正矩阵。此步骤可有效消除不同通道间的光谱串扰，提高多重检测准确度。

5. 生成校准报告

报告中显示每个通道的灵敏度系数、线性范围及信噪比。若部分通道信号偏低，软件会提示清洁光学窗口或更换光源模块。

六、参考荧光与背景校准

在使用ROX作为内参染料时，系统需建立标准荧光基线以归一化信号波动。

1. 参考荧光校准
   选择“ROX Reference Calibration”选项，使用带有固定浓度ROX染料的标准板。系统测量各孔信号差异，计算校正因子，以在实验中实现信号标准化。

2. 背景噪声校准
   空仓状态下执行“Background Calibration”。系统会在无荧光条件下记录基线噪声，自动扣除背景值，减少系统干扰。

七、通道一致性与线性响应测试

为确保不同通道的信号响应线性一致，可通过“Linearity Test”功能检测。

操作步骤：

1. 使用不同浓度的标准荧光溶液（如10⁶至10²拷贝梯度）。

2. 运行校准程序，系统自动绘制荧光强度与浓度关系曲线。

3. 若线性相关系数R²≥0.99，说明通道响应正常；若偏离标准，需重新执行光学校准。

八、校准周期与维护计划

为保持设备长期精度，建议制定如下校准周期：

• 光学校准：每3–6个月执行一次；

• 温控校准：每6–12个月执行一次；

• 综合系统校准：每年或设备搬运、维修后进行；

• 若仪器长期高频使用或处于高湿环境，校准周期应适当缩短。

此外，建议每次软件或固件更新后进行快速光学验证，确保参数兼容。

九、校准过程中的注意事项

1. 保持清洁：校准板使用后应及时擦拭并存放在防光盒中，避免灰尘与荧光衰减。

2. 环境稳定：校准过程中避免震动、温度波动或强光干扰。

3. 操作规范：严禁用手直接接触光学窗口或校准板底部。

4. 数据备份：在校准前建议备份原始校准参数，防止异常情况下恢复困难。

5. 校准结果验证：校准完成后可运行标准样品测试，验证系统响应是否一致。

十、常见问题与解决方案

1. 校准失败提示“Optical Error”
   检查校准板是否放反、是否存在污渍；若光源老化，可更换LED模块。

2. 温度校准未通过
   可能由于通风不良或加热模块污染，需清洁模块表面并重新执行校准。

3. 通道信号不一致
   执行通道串扰校准或清洁光学系统。必要时联系技术支持更换滤光片组。

4. 校准数据无法保存
   确认软件是否具备管理员权限或硬盘空间充足。

5. 荧光强度下降
   检查封膜是否反光、样品仓是否积尘。光源长期使用后可进行强度重新标定。

十一、验证与记录管理

每次校准完成后，QuantStudio 3都会自动生成校准报告，报告内容包括：

• 校准日期与执行人员；

• 校准板批次与校准参数；

• 每通道校正系数、温度误差值；

• 校准是否通过的判定结果。

实验室应建立设备校准档案，将校准报告打印存档，以满足质量体系管理和审计要求。定期审查校准记录可发现潜在的系统偏差并及时修正。

十二、延伸：校准与质量控制结合

在日常实验中，校准应与质量控制（QC）结合执行。

• 每次重大实验前进行快速光学验证；

• 定期检测扩增标准样品，验证Ct值是否在历史平均范围内；

• 若Ct值波动超出标准偏差，应立即检查校准状态。

这种将校准与QC结合的策略，能确保QuantStudio 3在长期运行中始终保持高可靠性。

十三、校准后的性能验证

完成校准后，建议使用标准DNA模板或参考质控品进行验证实验。若温控与光学系统校准准确，重复实验的Ct值差异应小于0.5，标准曲线的扩增效率应在90%–110%之间，线性相关系数R²≥0.99。若结果不达标，应重新执行相应校准步骤。