一、扩增曲线概述

QuantStudio 3实时荧光定量PCR仪是赛默飞公司开发的中小通量核酸检测系统，其核心功能之一是通过扩增曲线实时监控DNA或RNA模板的扩增过程。扩增曲线（Amplification Plot）是PCR反应中荧光信号随循环次数变化的可视化表达，直接反映模板数量的动态变化过程，是判断反应效率、特异性及计算Ct值的基础。

扩增曲线不仅代表PCR反应的物理变化过程，更是数据分析的关键依据。它由系统在每个循环实时检测荧光强度而生成，通过算法平滑与背景扣除处理后，形成标准的S型曲线。正确理解扩增曲线的形态和特征，有助于优化实验条件、提高检测灵敏度和结果精确性。

二、扩增曲线的形成原理

在PCR反应中，DNA模板在温度循环作用下经历变性、退火和延伸三个阶段。每完成一个循环，目标DNA片段的数量理论上翻倍。QuantStudio 3通过荧光染料或特异性探针实时监测产物的累积量，并将每一循环的荧光信号记录下来。

仪器光学模块发射特定波长的激发光，激发体系内的荧光染料分子产生荧光。探测器接收发射信号并转化为数字信号，系统软件再对其进行归一化、背景扣除和平滑处理，最终生成反映扩增进程的曲线。荧光强度与扩增产物量成正比，因此曲线的上升部分代表模板数量的指数增长过程。

三、扩增曲线的基本阶段

QuantStudio 3生成的标准扩增曲线可分为四个典型阶段：

1. 基线阶段（Baseline Phase）：
   反应初期产物量极少，荧光信号接近背景噪声。曲线呈水平状态，此阶段主要用于确定基线范围。

2. 指数增长阶段（Exponential Phase）：
   PCR反应效率最高的阶段，产物量以指数倍增长，荧光信号急剧上升。系统在此阶段设定阈值线（Threshold Line），Ct值即为曲线与该线的交点。

3. 线性增长阶段（Linear Phase）：
   随着底物消耗和酶活性下降，扩增效率逐渐减缓，曲线趋于平缓。

4. 平台阶段（Plateau Phase）：
   反应体系进入饱和，产物数量不再显著增加，曲线达到平台。

完整的S形扩增曲线标志着反应顺利完成，是结果可靠的重要标志。

四、扩增曲线的数学特征

扩增曲线可用数学函数模型描述，其一般形式近似为Sigmoid曲线。QuantStudio 3软件通过非线性回归算法拟合曲线，提取关键参数。

• Ct值（Cycle threshold）：荧光信号首次超过阈值时的循环数，用于定量分析。

• ΔRn值：表示荧光信号相对变化量，是Rn（反应荧光）与Rn0（基线荧光）的差值。

• 扩增效率（E）：由标准曲线斜率计算得出，理想效率为100%，对应斜率–3.32。

通过对曲线数学建模，可以精确计算样品的相对表达量或拷贝数。

五、QuantStudio 3扩增曲线的显示与操作

在QuantStudio Design and Analysis软件中，扩增曲线可在“Amplification Plot”界面查看。横轴为循环次数（Cycle），纵轴为ΔRn值。

用户可选择“线性坐标”或“对数坐标”显示：

• 在线性坐标下可清楚观察曲线整体变化；

• 在对数坐标下可突出指数增长阶段，便于判断Ct位置。

软件允许用户手动调整基线范围与阈值位置，以修正Ct值。当多个样品同时扩增时，每条曲线代表一个反应孔的信号变化，可通过颜色区分不同通道或靶标。

六、扩增曲线的类型与意义

1. 标准阳性扩增曲线

形态典型的S形，基线平稳、指数上升明显、平台稳定。表示反应体系完整、扩增效率理想。

2. 阴性曲线

曲线保持水平，无明显上升趋势，说明样品中无靶序列或体系抑制严重。

3. 非特异扩增曲线

曲线在后期出现缓慢上升，Ct值较大，可能因引物二聚体或污染引起。

4. 异常曲线

曲线形态不规则或信号波动大，常由气泡、样品不均、光学干扰或软件基线设定错误造成。

七、扩增效率与曲线陡峭度

扩增效率反映反应体系的放大能力，与曲线上升段的陡峭程度密切相关。效率高的反应，曲线上升迅速，Ct值较低；效率低则曲线平缓，Ct值偏大。

QuantStudio 3软件可通过标准样品系列计算扩增效率，其公式为：
E=(10−1/slope−1)×100%E = (10^{-1/slope} - 1) \times 100\%E=(10−1/slope−1)×100%
理想范围为90%–110%，当偏离此范围时需优化引物或反应条件。

影响曲线陡峭度的因素包括模板质量、引物浓度、退火温度、酶活性及反应体系纯净度。

八、阈值设定与Ct值确定

阈值线是决定Ct值的关键参考线。QuantStudio 3可自动或手动设定阈值。自动模式基于算法识别荧光上升区间并生成平均阈值，适用于多数实验。手动模式适用于特殊反应或信号波动较大的数据。

设定原则为：

• 阈值应处于指数上升段中部，不与基线或平台交叉；

• 所有样品应使用相同阈值以保证数据可比性。

Ct值越小代表初始模板量越高，是定量分析的重要依据。

九、重复性与数据一致性

在理想情况下，同一样品的重复孔应产生重叠的扩增曲线，Ct差异小于0.5。若重复性差，说明体系混合不均或操作误差较大。

QuantStudio 3提供统计分析功能，自动计算重复样品的平均Ct、标准差及变异系数（CV）。当CV小于5%时，实验结果被认为具有良好一致性。

十、影响扩增曲线的主要因素

1. 模板质量：降解或污染的模板会导致曲线拖尾或荧光不稳定。

2. 引物设计：过长、过短或二聚体结构会影响反应效率。

3. 反应体系：Mg²⁺浓度、缓冲液pH和酶活性均对曲线形态产生影响。

4. 温控精度：温度波动会造成曲线不稳定。

5. 荧光探针稳定性：探针降解会导致信号弱或延迟。

6. 样品气泡与封膜不良：引起光学信号干扰，导致曲线震荡。

确保每个环节的准确控制是获得标准曲线的基础。

十一、扩增曲线异常及排查

1. 曲线无上升：模板浓度过低或酶失活，检查试剂及PCR程序。

2. 曲线上升过早：可能有污染或非特异扩增，应更换水样及对照。

3. 曲线过于平缓：扩增效率低，可优化退火温度或延伸时间。

4. 多峰现象：引物特异性差或存在多产物，需重新设计引物。

5. 曲线抖动或波动：光学模块受干扰或封膜起皱，应检查板封和样品定位。

QuantStudio 3系统具备自动异常识别功能，软件可标记异常孔并提示用户复查。

十二、扩增曲线与熔解曲线的关系

在SYBR Green实验中，扩增曲线反映产物数量变化，而熔解曲线反映产物特异性。理想状态下，扩增曲线呈典型S形、熔解曲线单峰。若熔解曲线出现多峰或肩峰，说明扩增曲线中可能存在非特异信号。

结合两者分析可全面判断PCR反应质量，确保结果可靠性。

十三、不同实验类型的扩增曲线特征

1. 绝对定量实验：标准样品曲线应按模板浓度梯度排列，Ct值递增且线性相关。

2. 相对定量实验：内参与目标基因曲线应形态相似，差值（ΔCt）稳定。

3. 基因分型实验：不同等位基因在不同通道呈现独立曲线，交叉干扰小。

4. 阳性/阴性检测：阳性样品曲线上升明显，阴性孔保持基线。

通过比较曲线分布，可快速判断样品状态与实验结果。

十四、扩增曲线的优化策略

1. 优化引物设计：避免互补区域与二聚体形成。

2. 调整退火温度：高温提高特异性，低温提高效率。

3. 控制模板量：过量模板易导致平台提前，过低信号不足。

4. 改进反应体系：添加助剂如DMSO可改善高GC模板扩增。

5. 离心混匀样品：防止气泡干扰光路。

6. 统一阈值设置：保持数据可比性。

经过优化后，扩增曲线的陡峭度与重复性显著提升。

十五、数据输出与分析

QuantStudio 3在扩增结束后自动生成扩增曲线及结果表。用户可查看Ct值、ΔRn值、扩增效率及标准曲线参数。软件可导出多种格式数据，包括Excel表格、PDF报告和图像文件。

报告中包含每个样品的扩增曲线、统计参数及结果解释，适合科研记录与论文发表。

十六、扩增曲线在科研与临床中的应用

扩增曲线不仅是技术参数的表现，更是科研与临床应用的重要依据。

• 基因表达分析：通过比较不同处理组的扩增曲线位置，判断基因上调或下调。

• 病原检测：Ct值的变化可反映病毒或细菌载量水平。

• 拷贝数分析：标准曲线法可计算样品中目标基因拷贝数。

• 突变检测与分型：不同等位基因扩增曲线差异用于基因型判断。

在临床检测中，快速上升且Ct较小的曲线通常代表阳性样品，而无明显上升的曲线为阴性结果。

十七、扩增曲线与系统性能的关系

扩增曲线质量在很大程度上体现QuantStudio 3的光学与温控性能。若温控系统稳定、光学信号灵敏且算法精确，曲线形态将平滑且重复性高。赛默飞在仪器出厂前会进行孔间一致性和温度精度测试，以保证每条扩增曲线都能真实反映扩增动态。

同时，QuantStudio 3软件通过算法优化，实现了基线漂移校正与信号噪声抑制，使曲线更加清晰。