一、实验前准备

在正式开始实验前，应首先完成环境与设备的准备。实验室需具备洁净、干燥、无强电磁干扰的操作空间。PCR实验区域建议分为样品制备区、体系配制区与扩增分析区，以防止交叉污染。

1. 仪器状态检查

通电前确认仪器摆放平稳，通风良好。打开QuantStudio 3电源后，系统会自动进行硬件自检，包括温控模块、光学检测模块和风冷系统。若屏幕提示“System Ready”，说明设备状态正常。应定期执行温度校准与光学校准，以确保数据准确。

2. 耗材与试剂准备

实验耗材需为专用的光学透明PCR板或0.1 mL PCR管，并使用配套封膜以保证荧光信号透射。试剂需在低温保存，使用前置于冰上融化。常用试剂包括：

• qPCR Master Mix（含SYBR Green或TaqMan探针体系）；

• 引物与探针；

• 模板DNA或cDNA；

• 无RNA酶水（RNase-free Water）；

• 内参基因标准样品（若为相对定量实验）。

3. 模板与引物质量控制

模板DNA需纯度高、无蛋白或有机物残留，A260/A280比值在1.8–2.0之间。引物应经序列特异性验证，长度一般为18–24个碱基，扩增片段建议在80–200 bp。

二、反应体系建立

反应体系配置是实验成功的关键。体系体积常设为20 μL或25 μL。以下为标准体系示例（以SYBR Green法为例）：

• 2× Master Mix：10 μL

• 上游引物（10 μM）：0.5 μL

• 下游引物（10 μM）：0.5 μL

• 模板DNA：1–2 μL

• 无RNA酶水补足至总量20 μL

若采用TaqMan探针法，则需额外加入探针0.25 μL，并调整水量以保持体系总量不变。

反应体系应在冰上配制，混匀后轻轻离心，确保无气泡。为减少操作误差，建议采用多通道移液器或制备混合母液。每个样品建议设置三次重复孔，以提高统计可靠性。

三、孔板布局与样品录入

QuantStudio 3配套软件提供直观的96孔板布局界面。用户可通过点击或批量填充方式定义每个孔的内容。

1. 样品类型定义

• Unknown（未知样品）：实验待测样本；

• Standard（标准样品）：用于绘制标准曲线的梯度稀释样品；

• NTC（阴性对照）：不含模板，用于检测污染；

• Control（阳性对照）：已知浓度样本，用于验证体系稳定性。

2. 通道与探针分配

若使用多通道荧光检测，可在布局界面为每个目标分配荧光通道。常见配置如下：

• FAM通道：目标基因；

• VIC/HEX通道：内参基因；

• ROX通道：被动参考荧光，用于信号校正。

系统支持通道同步采集与多重检测，可同时分析多个基因靶标。

四、扩增程序设置

扩增程序设置直接决定PCR反应的成功与检测灵敏度。进入软件“Run Method”界面后，编辑扩增步骤。

1. 标准程序设置

• 初始变性：95℃，2分钟；

• 循环阶段（40次）：

• 变性：95℃，15秒；

• 退火/延伸：60℃，1分钟（采集荧光信号）；

• 熔解曲线分析（若使用SYBR Green法）：

• 60℃升至95℃，每0.05℃采集一次荧光信号。

2. 梯度温度实验

为确定最佳退火温度，可启用“Temperature Gradient”功能，选择多个孔位设定不同退火温度（通常55℃–65℃范围）。

3. 荧光采集策略

选择“Collect Fluorescence”选项，使系统在延伸阶段采集荧光。若为多通道实验，应分别启用每个通道。采集频率可调整为每循环一次或多点采样。

五、实验运行与实时监控

将封膜后的反应板轻轻离心，确保液体均匀分布后放入样品仓。关闭盖板后，点击“Start Run”启动实验。

运行过程中，软件实时显示扩增曲线、温度变化曲线与荧光强度数据。用户可随时切换视图查看单通道或多通道扩增状态。

系统自动记录每个循环的Ct值估算、信号强度与样本状态。若检测到异常（如温控不稳定或光学干扰），系统会提示“Check Thermal Block”或“Low Signal Warning”。实验可在中途暂停并继续运行，不影响已完成数据。

实验结束后，系统自动保存原始数据文件（.eds格式），并进入分析界面。

六、扩增结果分析

实验完成后，QuantStudio 3软件自动进行数据计算与图形生成。

1. 扩增曲线分析

扩增曲线呈“S型”，前期为基线阶段，中期为指数增长，后期趋于平台。系统自动绘制Ct阈值线，计算每孔Ct值。若重复孔Ct差异>0.5，应检查体系均一性。

2. 标准曲线与扩增效率

对于绝对定量实验，系统根据标准样品浓度绘制标准曲线，计算扩增效率E与线性相关系数R²。理想效率为90%–110%，R²≥0.99。

3. 熔解曲线分析

若使用SYBR Green染料，系统会自动生成熔解曲线，用于验证扩增产物特异性。理想曲线应呈单峰；多峰或宽峰提示非特异性扩增或引物二聚体形成。

七、数据解读与结果输出

QuantStudio 3软件支持自动与手动两种结果分析模式。

1. Ct值解读

Ct值反映样品中目标模板的初始量。模板浓度高，Ct值越小；浓度低，Ct值越大。一般Ct值>40视为阴性信号。

2. 相对定量计算

在基因表达研究中，常使用ΔΔCt法计算表达倍数。
ΔCt = Ct(目标基因) - Ct(内参基因)
ΔΔCt = ΔCt(实验组) - ΔCt(对照组)
相对表达量 = 2^-ΔΔCt

3. 绝对定量结果

根据标准曲线方程，系统自动换算样品浓度或拷贝数，并生成统计表。用户可通过图表直观比较样品间差异。

4. 数据导出与报告生成

分析完成后，点击“Export Results”导出Ct值、标准曲线及图形文件。支持导出Excel、CSV或PDF格式，并可添加实验信息、操作人员及样品备注。

八、实验质量控制

在整个实验流程中，质量控制是确保数据可靠的核心。

1. 阴性对照（NTC）：若出现扩增信号，说明体系污染，应重新制备。

2. 阳性对照：Ct值应稳定，波动不应超过±0.5，否则表示体系或酶活异常。

3. 重复孔一致性：CV值小于2%为理想。

4. 熔解峰验证：单一峰表示特异性扩增；多峰说明引物需优化。

此外，实验完成后应保存系统日志与原始数据文件，确保可追溯性。

九、常见问题与排查

1. 无扩增曲线或Ct值过高：
   模板浓度太低、引物降解或扩增程序错误。建议重新配制体系并验证引物质量。

2. 熔解曲线出现多峰：
   可能为引物二聚体，调整退火温度或优化引物序列。

3. 扩增效率偏低：
   检查模板纯度或使用新鲜酶体系，确保反应组分比例正确。

4. 重复孔差异大：
   可能为移液误差或气泡干扰，建议预混母液并轻轻离心。

十、实验后维护与数据管理

实验结束后，应立即清理样品仓与光学窗口，避免荧光染料残留影响后续实验。使用无酒精湿巾轻擦窗口表面，保持清洁。

系统数据文件可在主界面“Project Library”中查看、备份或导出。为保证长期稳定运行，每月建议执行一次系统维护：

• 温控模块验证；

• 光学通道校准；

• 软件更新检查。

关闭仪器时，应确保主程序退出并保存数据，再切断电源。

十一、实验优化建议

• 优化引物浓度可显著改善信噪比。常见范围为0.1–0.5 μM；

• Mg²⁺离子浓度对酶活影响明显，应保持一致；

• 样品量过高会导致荧光饱和，可适当稀释；

• 若多重检测通道间信号干扰，应调整荧光探针浓度；

• 实验前确保反应体系无气泡，否则可能造成光学误差。