一、软件概述与功能结构

QuantStudio 3的软件系统由两部分组成：仪器控制端界面和电脑端分析平台。仪器控制端为触摸式操作界面，主要用于实验建立、程序设置与实时监控；电脑端软件则提供更强大的数据分析与可视化功能。

软件采用模块化设计，主要包含以下功能模块：

1. 实验管理模块：用于新建、编辑、保存与导入实验文件。

2. 程序编辑模块：用于设置PCR扩增的温度循环参数与荧光采集模式。

3. 板布局模块：定义样品、标准、对照及未知样本的孔位分布。

4. 数据采集模块：实时显示扩增曲线、温度曲线与运行进度。

5. 数据分析模块：提供Ct值计算、标准曲线绘制、相对表达量分析与熔解曲线判断等功能。

6. 报告导出模块：生成可定制的实验报告，支持多种文件格式。

整个软件系统遵循“实验设计—参数设置—实时采集—数据分析—结果输出”的工作逻辑，适合不同层次用户的操作需求。

二、软件登录与实验文件建立

启动软件后，进入主界面。用户可选择“新建实验”、“打开实验”或“模板导入”。

• 若进行首次实验，点击“新建实验”，系统将弹出实验类型选择界面。

• 实验类型包括：绝对定量（Absolute Quantification）、相对定量（Relative Quantification）、标准曲线法（Standard Curve）、熔解曲线分析（Melt Curve）和多重检测（Multiplex）。

选择实验类型后，系统会自动生成相应的默认参数模板。用户可在“实验信息”窗口中输入项目名称、操作者、样品编号和日期，以便后续追踪。

实验文件保存格式为.eds，可直接在电脑端打开或导入至仪器主机运行。软件支持版本兼容，旧版实验文件也可自动升级。

三、板布局与样品设置

在“Plate Setup（板布局）”界面，用户需定义样品、标准品、对照与未知样本的孔位。

软件提供96孔板视图，每个孔以颜色区分类型。用户可以：

• 单击孔位手动输入样品名；

• 使用“批量填充”功能快速复制样品名称；

• 通过导入Excel模板实现自动布局。

样品类型包括“Unknown（未知样品）”、“Standard（标准）”、“NTC（阴性对照）”和“Control（阳性对照）”。
对于相对定量实验，还需设定目标基因（Target）与内参基因（Reference）。系统允许为每个目标分配不同的荧光通道，以支持多重检测。

在“Assign Targets”选项中，可为每个孔选择目标名称和荧光探针颜色。例如FAM通道检测目标基因，VIC通道检测内参基因。所有设定完成后，系统会生成孔位与通道对应表，便于后续分析。

四、扩增程序与参数编辑

点击“Run Method（运行方法）”进入扩增程序设置界面。系统提供可编辑的温度循环表格，每一行对应一个步骤。

常见的扩增程序包括：

1. 初始变性：95℃，2分钟；

2. 循环阶段：95℃，15秒；60℃，1分钟，共40个循环；

3. 熔解曲线阶段（可选）：60℃至95℃，升温速率0.05℃/秒。

在每个步骤右侧可启用“Collect Fluorescence（采集荧光）”选项，表示在该步骤结束时采集荧光信号。
系统支持设置升降温速率与保持时间，可针对不同反应体系进行优化。

此外，软件可保存多个程序模板，用户可根据实验类型快速加载。对于梯度实验，可选择“Temperature Gradient”功能，系统会在多个孔位设置不同退火温度，以确定最佳条件。

五、实时监控与实验运行

完成程序设置后，点击“Start Run”开始实验。软件自动检测温控模块、光学系统及样品仓状态。若检测通过，系统进入实时运行界面。

在运行过程中，界面实时显示：

• 每个孔位的扩增曲线；

• 当前循环数与剩余时间；

• 温度变化曲线；

• 各通道荧光强度实时图。

用户可随时暂停实验以检查样品情况或调整采集参数。暂停不会影响已完成循环的荧光数据。

系统还提供“Amplification Status Summary（扩增状态摘要）”窗口，显示每个样本的初步Ct值、荧光信号强度及曲线形态，便于即时判断实验进展。

六、数据分析与Ct值计算

实验完成后，软件自动进入“Analysis（分析）”模块。系统首先根据设定的基线与阈值自动计算Ct值。

在“Amplification Plot”窗口中，用户可以：

• 选择单一或多通道显示；

• 手动调整阈值线位置；

• 放大特定样本曲线进行比对。

软件支持多种Ct值计算方式：

• 自动阈值法（Auto Threshold）：软件根据指数增长区间计算最优阈值；

• 固定阈值法（Fixed Threshold）：用户设定统一阈值，用于多批次比较；

• 动态基线法（Dynamic Baseline）：自动识别稳定基线区间并修正漂移。

Ct值表格可显示平均Ct、标准差、扩增效率及R²值。重复孔的Ct差异若超过0.5，软件将自动标记为异常值。

七、标准曲线与扩增效率分析

对于绝对定量实验，软件可生成标准曲线并计算扩增效率。

步骤如下：

1. 在“Standard Curve”窗口选择标准孔；

2. 输入每个标准样本的浓度或拷贝数；

3. 点击“Generate Curve”自动绘制Ct-Log(浓度)曲线。

软件计算公式：
E = (10^(-1/slope) - 1) × 100%
理想扩增效率为90%–110%，R²应大于0.99。

若效率偏离范围，系统会提示用户优化实验条件，如调整退火温度、引物浓度或模板量。

八、相对定量与ΔΔCt分析

在相对定量模式下，软件根据目标基因与内参基因的Ct差异计算表达倍数。

分析流程：

1. 在“Analysis Settings”中设定参考样本（通常为对照组）；

2. 系统自动计算ΔCt = Ct(target) - Ct(reference)；

3. 计算ΔΔCt = ΔCt(sample) - ΔCt(control)；

4. 输出表达倍数：Fold Change = 2^-ΔΔCt。

结果以图形形式呈现，柱状图显示不同处理组的表达变化，并可添加误差线。用户还可导出表格数据进行统计分析。

九、熔解曲线分析与特异性判断

对于使用SYBR Green染料的实验，熔解曲线分析是判断产物特异性的关键步骤。

点击“Melt Curve”选项，系统显示荧光信号随温度上升的变化图。
软件自动绘制负导数曲线（-dF/dT），每个特异扩增产物对应一个熔解峰。

理想情况下，每个样品应呈单一尖锐峰，且重复孔峰值温度（Tm）一致。
若出现多个峰或宽峰，说明存在非特异扩增或引物二聚体。用户可调整引物设计或退火温度解决问题。

十、结果可视化与报告生成

QuantStudio 3软件提供多种可视化方式，包括：

• 扩增曲线图（Amplification Plot）；

• 熔解曲线图（Melt Curve）；

• 标准曲线图（Standard Curve）；

• Ct值分布图（Ct Value Distribution）；

• 表达倍数图（Fold Change Plot）。

用户可自定义配色方案与图表样式，添加标题、图例及说明文字。所有图表可导出为高分辨率图片或PDF文件，用于科研报告或论文。

在“Report”界面中，可选择包含的内容（实验信息、曲线图、Ct表格、标准曲线、统计结果等），系统自动生成完整报告文档。报告格式支持PDF、Excel、CSV等多种输出形式。

十一、数据管理与项目归档

软件具备完善的数据管理功能，可按实验日期、样品类型或研究项目分类存储。用户可在“Project Library”中建立文件夹，实现实验记录的长期归档。

支持多用户操作模式，不同研究人员可独立保存实验数据。系统还提供“Audit Trail（审计追踪）”功能，记录每次修改和分析步骤，确保数据溯源性与合规性。

实验数据可备份到云端或导出至U盘，以防电脑端数据丢失。

十二、软件优化与更新建议

1. 定期检查软件版本并执行更新，以获取最新算法与兼容性增强。

2. 实验前清空缓存文件，确保运行流畅。

3. 若出现软件卡顿，可关闭后台图表实时刷新功能。

4. 定期备份模板设置文件，便于批量实验快速启动。

5. 建议定期进行系统校准（光学与温控模块），保持分析精度。

十三、常见问题与解决方案

• 问题1：Ct值未显示或为零
  检查是否启用了“Collect Fluorescence”选项或阈值线设置不当。

• 问题2：扩增曲线抖动明显
  可能由样品气泡或板膜反光引起，应重新封板并检查光学窗口。

• 问题3：标准曲线R²偏低
  检查标准品稀释精度，避免移液误差。

• 问题4：熔解曲线峰值不一致
  样品浓度差异或反应体系不均，需优化引物或反应条件。