一、实验类型与模板选择

在设置实验参数前，首先要确定实验类型。QuantStudio 3软件提供多种实验模板，包括绝对定量、相对定量、标准曲线法、基因表达分析、熔解曲线分析及多重检测模式。

对于绝对定量实验，系统通过标准曲线拟合目标基因的初始模板浓度。用户需在“标准样本设置”中输入不同稀释倍数的标准品浓度，软件将自动绘制标准曲线并计算扩增效率。

对于相对定量实验，系统使用ΔΔCt算法分析目标基因与内参基因的相对表达量。此时需设定参考样本、目标基因及内参基因的对应关系，并保持扩增效率一致。

对于熔解曲线分析，系统在扩增完成后通过缓慢升温检测双链DNA的解链特性，从而判断扩增特异性。此模式下需要启用“熔解曲线采集”参数并设置升温速率与荧光采集频率。

二、温控参数设置

温度控制模块是QuantStudio 3的核心组成部分，决定了PCR反应的准确性与重复性。温控参数主要包括循环次数、变性温度与时间、退火温度与时间、延伸时间及速率等。

1. 初始变性阶段：用于完全解链DNA模板，一般设为95℃，持续2分钟，可确保双链DNA完全分离。

2. 循环阶段：每个循环包括变性、退火与延伸三个步骤。

• 变性温度通常设为95℃，时间为10-15秒；

• 退火温度取决于引物Tm值，一般在55℃至65℃之间，时间为20-30秒；

• 延伸温度多设为60℃，持续30-60秒，根据产物长度调整。

3. 循环次数：常规qPCR设定为40个循环，若样品浓度极低，可适当增加至45个循环。

4. 升降温速率：QuantStudio 3支持2.5℃/秒的加热速率和2.0℃/秒的降温速率，用户可根据反应体系调整以平衡灵敏度与效率。

5. 熔解曲线设置：若进行熔解曲线分析，起始温度通常设为60℃，终止温度为95℃，升温速率为0.05℃/秒，并在每个温度点采集荧光信号。

温控均一性是QuantStudio 3的一大优势，其孔间温差控制在±0.25℃以内，保证样品扩增一致性。建议定期进行温度校准，以维持长期精度。

三、荧光通道与光学参数设置

QuantStudio 3配备四通道光学系统，可同时检测多种荧光染料或探针。用户在设置实验时需根据所使用的荧光染料选择对应通道。

常用荧光通道参数如下：

• FAM：激发波长495 nm，发射波长520 nm

• VIC/HEX：激发波长535 nm，发射波长555 nm

• ROX：激发波长575 nm，发射波长610 nm（常用作内参）

• CY5：激发波长650 nm，发射波长670 nm

在软件界面中，用户可在“检测设置”中勾选对应通道，并为每个通道指定目标基因名称。若使用SYBR Green染料检测，则选择单通道采集模式，并开启熔解曲线分析；若使用TaqMan探针体系，可选择双通道或多通道同步采集模式。

系统允许自定义荧光采集点，可选择在延伸阶段结束时采集一次荧光信号，或在延伸阶段内多点采集，以提高曲线平滑度。

四、反应体系与孔板布局设置

在“孔板布局”界面，用户需定义样品类型、标准曲线孔位、对照组及未知样本。QuantStudio 3软件支持拖拽式布局编辑，可快速批量分配孔位。

反应体系体积一般为20 μL或25 μL，推荐配方为：

• 模板DNA：1–2 μL（约10–100 ng）

• 引物对（10 μM）：各0.5 μL

• 探针（若有）：0.25 μL

• 2× qPCR Master Mix：10–12.5 μL

• 无RNA酶水补足至最终体积

建议使用光学透明PCR板和专用封膜，以保证信号传输稳定。孔板放入样品仓前，应检查液面平整，避免气泡干扰光学检测。

五、阈值线与基线设置

荧光信号的阈值线与基线范围直接影响Ct值计算。QuantStudio 3软件可自动计算阈值，也允许用户手动设定。

1. 基线范围：通常设置在第3到第15个循环之间，此阶段的荧光信号应处于稳定的背景水平。

2. 阈值线：应设在指数扩增区间内，并高于背景噪音信号。自动阈值算法会根据荧光增长速率计算最优位置。

3. Ct值计算：系统在扩增曲线与阈值线交叉点处读取循环数，作为该样品的Ct值。若同一样品重复孔Ct值差异超过0.5，应检查反应体系均一性或液体分配精度。

用户可在“曲线视图”中实时调整阈值并观察Ct值变化，以确保所有样本曲线在同一阈值线下分析。

六、扩增效率与标准曲线设置

对于绝对定量实验，系统可根据标准品序列绘制标准曲线。标准曲线的线性相关系数R²应≥0.99，扩增效率在90%至110%之间。

在“标准设置”界面，输入标准样本的浓度梯度，例如10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²拷贝/μL，系统会自动计算斜率和截距。若扩增效率偏离理想值，可通过优化退火温度、引物浓度或模板质量进行调整。

对于相对定量分析，需确保目标基因与内参基因的扩增效率基本一致，否则ΔΔCt结果会产生系统误差。

七、数据采集与分析参数

QuantStudio 3允许用户自定义荧光采集频率、数据平滑算法与噪声校正方式。

• 采集频率：默认为每循环采集一次荧光信号，可设为每个温控步骤后采集一次，以提高实时监控精度。

• 信号平滑：系统可采用移动平均法消除噪声，平滑窗口一般设置为3–5个点。

• 信号校正：启用ROX通道作为被动参考荧光，以校正光源波动和体系差异，提高定量准确性。

在“分析参数”中，用户可选择自动识别阳性扩增孔或设置最小荧光增长阈值。对重复样本，可启用平均Ct计算功能。

八、实验验证与重复性评估

实验完成后，应首先检查扩增曲线是否呈典型S型。若出现延迟或不完全扩增，可分析引物设计或模板浓度是否合理。系统自带扩增效率评估工具，可根据标准曲线计算每个通道的效率并生成验证报告。

重复性评估可通过标准差与变异系数（CV）计算完成。若CV值小于2%，说明体系稳定性良好。

九、软件分析与结果导出

QuantStudio 3的软件平台支持多种分析模式。

• 在绝对定量分析中，软件根据标准曲线计算未知样本浓度。

• 在相对定量分析中，可直接选择参考样品和内参基因，系统自动生成表达倍数变化图。

• 在熔解曲线分析中，系统绘制一阶导数曲线，以判断扩增产物特异性。

实验结果可导出为多种格式，如Excel、CSV或PDF。系统还可生成自动化报告，包括Ct值表、扩增曲线、标准曲线及熔解曲线图。

十、参数优化与注意事项

1. 退火温度应根据引物的Tm值优化，差距不应超过2℃。

2. 若多重检测中存在通道干扰，应降低荧光探针浓度或调整光学滤光设置。

3. 模板浓度过高可能导致荧光信号饱和，应进行适当稀释。

4. 对于RNA模板实验，反转录效率和cDNA质量直接影响Ct值，应采用高纯度反转录体系。

5. 在首次运行新体系前，可进行梯度温度测试，以确定最佳退火温度。

十一、系统校准与维护设置

为保持参数长期准确，应定期执行系统校准。

• 温控校准：使用标准温度板验证加热模块的准确性。

• 光学校准：利用标准荧光板校准各通道信号响应。

• 软件参数备份：通过系统菜单导出参数设置文件，以防意外丢失。

在每次实验结束后，应清洁样品仓并关闭电源，避免热残留。若长时间未使用，建议运行一次空板校准程序，以确保温控系统稳定。