赛默飞荧光定量PCR仪QuantStudio 3操作步骤
一、仪器概述
QuantStudio 3实时荧光定量PCR仪是赛默飞公司推出的中小通量实时PCR检测系统，适用于基因表达分析、核酸定量检测、SNP基因分型、拷贝数分析、熔解曲线分析及病毒载量检测等多种应用。该设备以高灵敏度、高重复性、操作简便、软件分析功能强大著称，采用Peltier温控模块进行快速升降温，配合精确的光学检测系统，可实现多重荧光信号的同步采集。仪器配备触控操作界面，也可通过QuantStudio Design and Analysis软件在计算机端进行实验设计与数据处理。
二、实验前准备
在操作仪器前应进行充分准备，以确保实验结果的准确性。首先，检查仪器电源、连接线及样品槽的清洁状态。开启仪器前应确认温控模块干净无液体残留，避免样品污染或短路。其次，准备PCR反应体系，包括反应缓冲液、引物、探针、模板、荧光染料（如SYBR Green或TaqMan探针）及酶混合物。所有试剂应在冰上配制，避免反复冻融造成活性损失。
样品管或96孔板应洁净无气泡，封膜应紧密平整以防蒸发。加载样品后，用离心机短暂离心，使反应液均匀分布于孔底。对于使用96孔板的实验，应在加载完毕后使用透明封膜密封，并注意防止交叉污染。最后，将样品编号记录清晰，与设计模板一一对应，方便后续数据分析。
三、仪器启动与系统登录
打开QuantStudio 3主机电源，系统启动后进入主界面。若使用计算机控制，应启动QuantStudio Design and Analysis软件，并连接主机。软件会自动识别仪器型号及序列号，确保连接状态为“Ready”。操作人员可使用本地账户或云端账户登录Thermo Fisher Cloud，以便保存与共享实验数据。
在登录成功后，系统会显示“主页”界面，可选择“新建实验（New Experiment）”“运行实验（Run Experiment）”“查看结果（View Results）”等功能模块。
四、实验创建与参数设置
1. 新建实验文件
选择“New Experiment”后，系统会提示输入实验类型。根据实验目的选择相应模式，如“Standard Curve Quantification（标准曲线定量）”“Comparative Ct（ΔΔCt相对定量）”“Genotyping（基因分型）”“Presence/Absence（阳性检测）”等。
2. 输入实验信息
在“Experiment Properties”界面中输入实验名称、操作者、项目编号、仪器ID及板类型（如96-well）。这些信息将嵌入实验文件中，便于追踪与管理。
3. 设置反应体系
进入“Plate Setup”界面后，导入或手动录入样品信息。每个孔可标注样品名、靶基因名称、荧光通道（FAM、VIC、ROX、SYBR等）及是否为对照样品。若使用标准曲线法，可指定标准浓度系列；若进行相对定量，可指定内参基因与目标基因对应关系。
4. 设定循环条件
在“Thermal Profile”界面设置反应程序。一般实时定量PCR反应包括以下阶段：
（1）初始变性：95°C，2分钟，激活Taq酶并变性模板DNA；
（2）循环阶段：通常40个循环，每循环包括95°C变性10秒、60°C退火/延伸30秒；
（3）熔解曲线分析（SYBR Green法）：从60°C升温至95°C，每0.3°C采集荧光信号。
用户可根据酶特性、引物退火温度及实验类型适当调整程序。设置完成后保存模板，便于后续重复实验直接调用。
五、样品上机与运行
1. 加载反应板
确认PCR反应板密封完好后，将其放置在金属样品槽中。注意板孔方向应与仪器标识一致（A1孔在左上角）。放置后轻轻按压四周，使其贴合温控模块表面，避免温度不均导致扩增效率差异。
2. 关闭盖板与检测模块
合上仪器上盖，确保光学检测模块对准样品孔位。关闭后，屏幕会提示检测模块校准状态，若长期未校准，可选择自动执行光路校准以确保荧光信号准确。
3. 启动运行
点击“Run”按钮后，系统会要求确认程序参数及板信息。检查无误后开始运行。运行过程中，屏幕显示实时扩增曲线，包含每循环荧光强度变化、温度曲线及仪器状态。运行时间一般为60至90分钟，视程序设置而定。
六、数据采集与分析
1. 实时监测
在反应进行中，QuantStudio 3可实时显示荧光信号曲线，便于观察扩增趋势。若出现异常如无信号或背景过高，可立即中止实验并排查原因，如试剂失效或气泡干扰。
2. 实验结束与保存
运行完成后，仪器自动保存扩增数据并生成结果文件（.eds格式）。系统提示可直接在本地或云端存储。若选择云端同步，数据可跨设备访问和分析。
3. 结果分析
打开结果文件后，软件自动计算Ct值（循环阈值），并根据选择的分析方法进行结果展示。对于绝对定量实验，软件根据标准曲线自动生成浓度计算结果及线性相关系数（R²）与扩增效率。对于相对定量实验，软件计算目标基因相对表达量（2^-ΔΔCt），并可自动绘制柱状图或散点图。
在熔解曲线分析中，系统绘制温度—荧光导数曲线，以判断产物特异性。若出现多峰，说明存在非特异扩增或引物二聚体。
七、常见问题与排查
无荧光信号：检查是否加载正确荧光通道、探针或染料是否失效，样品是否含模板DNA。
扩增曲线异常：可能由气泡、封膜不严或反应体系配比不当引起，应重新配置体系并离心。
标准曲线线性差：检查稀释倍数是否准确、吸量是否一致。
熔解曲线多峰：说明引物特异性不足，可通过重新设计引物或优化退火温度解决。
系统提示温度错误：可能是加热模块接触不良，应重新放置反应板或联系技术支持。
八、实验结束与清理
实验结束后，待模块温度降至室温再取出反应板。用无尘布擦拭样品槽表面，避免残留液体或封膜碎片。若长时间不使用，应关闭主机电源并拔除插头。每周定期清洁光学模块及风道口，以保持检测灵敏度。仪器外壳可用70%乙醇擦拭，但严禁使用强腐蚀性溶剂。
九、软件高级功能介绍
QuantStudio 3配套软件除常规分析外，还具备多种高级功能。
（1）多因子比较分析：支持不同样品组间差异分析，可批量导入实验数据进行统计。
（2）基因分型模块：可自动识别不同基因型信号簇并输出分型结果。
（3）云端协作与报告生成：实验数据可同步至Thermo Fisher Cloud，自动生成标准化报告，支持PDF和Excel导出。
（4）设备远程控制：允许用户在云端监控运行状态并远程启动实验，提高实验室工作效率。
十、安全注意事项
操作QuantStudio 3时应遵守实验室安全规范。实验过程中应佩戴防护手套、防护眼镜及实验服，防止试剂接触皮肤。PCR实验区应与样品制备区分开，避免气溶胶污染。使用含荧光染料的试剂时，应避免强光照射，防止荧光衰减。定期校准仪器光学系统和温控模块，确保长期稳定运行。
十一、结果解读与报告
实验完成后，可在“Analysis”界面选择不同结果视图：扩增曲线、熔解曲线、Ct分布、标准曲线或相对表达图。用户可导出Ct值表格进行进一步统计分析。报告生成模块允许自动插入实验信息、运行参数及图表，形成完整检测报告，适用于科研记录及质量体系文件。
十二、维护与校准
QuantStudio 3具备自动诊断与维护提示功能。用户可在“Maintenance”界面查看温控、光学及风扇运行状况。每3个月应进行光学模块自检，每6个月进行温度校准。若检测灵敏度下降，可使用Thermo Fisher提供的校准板进行光路重新校准。长期停用前应覆盖防尘罩，并储存在干燥通风环境中。
