一、引言

基因表达定量分析在生命科学研究中具有重要意义，能够帮助我们了解基因的功能及其在不同生理、病理条件下的变化。随着高通量测序技术和实时定量 PCR（qPCR）技术的发展，基因表达的定量分析已成为许多科研项目和临床诊断的核心手段。准确的基因表达定量能够揭示疾病机制、寻找潜在的生物标志物、评估治疗反应等。

基因表达定量方法可以大致分为两大类：相对定量法 和 绝对定量法。不同的方法具有不同的应用范围、优势和限制，选择合适的定量方法对于实验结果的可靠性至关重要。本文将详细介绍基因表达定量的常用方法，探讨其原理、步骤、应用领域以及优化策略。

二、基因表达定量方法的基本原理

1. 基因表达定量的概念

基因表达是指基因信息通过转录和翻译过程转化为蛋白质或功能性 RNA 的过程。基因表达定量分析主要通过测定特定基因的 mRNA 或 cDNA 水平来评估其在不同条件下的表达量。通过定量分析，可以了解基因在细胞中的表达强度及其在不同实验条件、疾病状态或处理方式下的变化。

基因表达定量分析主要依赖于以下技术：

• 实时定量 PCR（qPCR）：通过监测荧光信号的变化，实时检测和定量基因的表达水平。

• RNA-Seq：高通量测序技术，能够在全基因组范围内定量基因表达。

• 微阵列（Microarray）：基于特定探针捕获目标基因的表达信息，进行定量分析。

2. 相对定量与绝对定量

基因表达定量分析可以采用两种主要的计算方法：

• 相对定量法：通过比较目标基因与内参基因（如 GAPDH、β-actin）的表达量差异，计算目标基因的相对表达水平。常用的计算方法有 ΔCt 法和 ΔΔCt 法。

• 绝对定量法：通过使用已知浓度的标准品绘制标准曲线，并通过标准曲线推算样品中目标基因的绝对浓度或拷贝数。

三、基因表达定量方法的常用技术

1. 实时定量 PCR（qPCR）

原理

实时定量 PCR（qPCR）技术利用荧光染料或探针监测 PCR 反应中荧光信号的变化，实时捕捉每个扩增周期的荧光强度，并通过荧光信号的变化推算基因的表达量。相较于传统的 PCR，qPCR 能够提供定量数据，而不仅仅是定性分析。

步骤

• 引物设计：根据目标基因的序列设计特异性引物。

• 反应体系配置：配置 PCR 反应体系，加入 2× PCR Master Mix、引物、模板（cDNA）、荧光染料（如 SYBR Green 或 TaqMan 探针）。

• 反应程序：设置 PCR 反应程序，包括预变性、变性、退火和延伸。

• 数据采集与分析：通过实时荧光信号的采集，生成扩增曲线和 Ct 值。通过标准曲线法或相对定量法计算基因的表达水平。

应用

实时定量 PCR 主要用于：

• 基因表达定量：通过比较目标基因与内参基因的表达水平，分析基因在不同条件下的表达差异。

• 疾病研究：通过监测疾病相关基因的表达水平，帮助揭示疾病的机制。

2. RNA-Seq

原理

RNA-Seq（RNA sequencing）是一种高通量测序技术，通过对全转录组的 RNA 进行高通量测序，分析基因的表达水平、剪接变异、基因融合等信息。RNA-Seq 不仅可以提供定量数据，还能发现新的转录本、基因和剪接位点。

步骤

• RNA 提取：从样本中提取高质量的 RNA。

• 反转录：将 RNA 转录为 cDNA。

• 文库构建与测序：构建 cDNA 文库并进行高通量测序。

• 数据分析：通过生物信息学工具分析测序数据，得到每个基因的表达水平。

应用

RNA-Seq 技术广泛应用于：

• 基因表达定量：可以对全基因组范围内的基因进行定量分析。

• 基因组注释：识别新的基因和转录本。

• 疾病相关基因研究：分析癌症、神经退行性疾病等疾病的基因表达变化。

3. 微阵列（Microarray）

原理

微阵列技术是通过固相支持物（如玻片、芯片）上固定成千上万的寡核苷酸探针，与标记的样本 RNA 进行杂交，从而检测特定基因的表达水平。微阵列技术可以同时检测数千到数万个基因的表达。

步骤

• RNA 提取与标记：从样本中提取 RNA，并进行反向转录生成标记的 cDNA。

• 杂交与洗涤：将标记的 cDNA 与微阵列芯片上的探针杂交，之后进行洗涤，去除非特异性结合的部分。

• 数据分析：通过检测荧光强度，确定每个基因的表达水平。

应用

微阵列技术适用于：

• 大规模基因表达分析：可以同时分析数千到数万个基因的表达水平。

• 基因表达谱分析：在不同实验条件下，比较基因表达的变化。

四、基因表达定量方法的优缺点

1. 实时定量 PCR（qPCR）

优点

• 高灵敏度：qPCR 对低丰度的目标基因具有较高的灵敏度，能够检测到极低浓度的 DNA 或 cDNA。

• 定量精确：qPCR 提供定量数据，可以精确测量基因的表达水平。

• 适用于小规模实验：适合检测少量样本的基因表达变化。

缺点

• 需要引物和探针设计：需要根据目标基因进行引物设计，且引物设计不好会影响实验结果。

• 依赖内参基因：相对定量法依赖内参基因作为标准化基因，内参基因选择不当可能影响结果的准确性。

2. RNA-Seq

优点

• 全面性：RNA-Seq 能够同时定量所有基因的表达，不依赖于先前已知的基因序列。

• 高通量：可以进行全基因组范围的表达分析，适用于发现新基因、新转录本和剪接变异。

• 无需预先设计引物：与 qPCR 不同，RNA-Seq 无需依赖特定引物进行实验。

缺点

• 成本较高：RNA-Seq 的实验成本较高，且数据分析复杂，需要高性能的计算平台。

• 数据处理复杂：RNA-Seq 产生的数据量巨大，需要专业的生物信息学软件进行分析。

3. 微阵列（Microarray）

优点

• 适用于大规模基因表达分析：可以同时检测成千上万个基因的表达水平，适用于大规模研究。

• 高通量：微阵列技术能够高效地生成大量的数据，适合大规模的样本比较。

缺点

• 灵敏度较低：相对于 RNA-Seq，微阵列在低丰度基因的检测灵敏度较低。

• 依赖已知探针：微阵列技术依赖于已知的基因探针，无法发现新的基因或转录本。

五、基因表达定量方法的优化策略

1. 引物优化

引物设计对于 PCR 定量分析的成功至关重要。优化引物设计可以提高扩增的特异性和效率，从而获得更准确的定量结果。

优化建议

• 确保引物长度在 18-30 个碱基之间，避免引物二聚体或发夹结构。

• 调整引物的 GC 含量和 Tm 值，使其尽可能接近。

2. 内参基因的选择

选择稳定、表达量一致的内参基因作为标准化基因，以确保相对定量的准确性。常用的内参基因包括 GAPDH、β-actin、18S rRNA 等。

优化建议

• 在不同的实验条件下验证内参基因的稳定性。

• 使用多个内参基因进行数据标准化，减少误差。

3. 反应体系优化

优化 PCR 反应体系可以提高扩增效率和特异性，从而获得更精确的基因表达定量结果。

优化建议

• 调整模板 DNA 的浓度，避免过高或过低的模板浓度。

• 优化反应体系中的 Mg²⁺ 离子浓度、dNTPs 浓度和聚合酶浓度。

4. 高质量的 RNA 提取

高质量的 RNA 提取是 RNA-Seq 和 PCR 定量分析成功的基础。RNA 的纯度和完整性直接影响实验结果的可靠性。

优化建议

• 使用适合的 RNA 提取试剂盒，确保 RNA 不受降解。

• 使用凝胶电泳或分光光度计检测 RNA 的完整性和纯度。

六、总结

基因表达定量分析是理解基因功能和调控机制的核心工具。在选择适合的定量方法时，研究人员需要考虑实验的需求、样本类型、预算限制等因素。实时定量 PCR（qPCR）适用于小规模、精确的基因表达分析，RNA-Seq 是一种高通量、全面的分析技术，适合全基因组范围的研究，而微阵列则适合进行大规模基因表达比较。

无论使用哪种方法，精确的实验设计、优化的实验条件以及合适的内参基因选择都是获得可靠结果的关键。通过不断优化实验步骤和策略，研究人员可以在基因表达定量分析中取得更高的准确性和精度，推动生物学研究的深入发展。