一、引言

实时定量 PCR（qPCR）技术是一种精确、灵敏的分子生物学技术，广泛应用于基因表达分析、基因突变检测、病原体检测、转基因检测等多个领域。与传统的 PCR 技术不同，实时定量 PCR 能够实时监测 PCR 反应中的荧光信号变化，通过信号强度的变化，定量分析样品中目标基因的浓度。成功的 qPCR 实验依赖于精确的实验配置、适当的反应条件及数据分析方法。

本篇文章将详细介绍实时定量 PCR 实验的配置方法，包括反应体系的组成、常用的荧光染料与探针、实验条件的设置、数据采集与分析方法，以及如何优化实验配置以获得高效、准确的实验结果。

二、实时定量 PCR（qPCR）实验配置的基本原理

1. qPCR 实验的原理

实时定量 PCR 技术通过引入荧光染料或探针，结合 PCR 反应的扩增过程，实时监测扩增产物的量。每个 PCR 循环结束后，设备会记录荧光信号的变化，并与扩增产物的量成正比。实验中最重要的一个参数是 Ct 值（循环阈值），即荧光信号首次超过设定阈值时的 PCR 循环数。Ct 值与目标基因的初始浓度成反比，Ct 值越低，表示样品中目标基因浓度越高。

荧光染料与探针

• SYBR Green：一种常用的荧光染料，能够与双链 DNA 特异性结合，随扩增产物的增加，荧光信号逐渐增强。

• TaqMan 探针：采用特异性探针与目标 DNA 序列结合，释放出荧光信号，相较于 SYBR Green，探针法具有更高的特异性。

2. qPCR 实验的组成

qPCR 实验需要配置适当的反应体系，其中包括 DNA 模板、引物、dNTPs、DNA 聚合酶、缓冲液、荧光染料或探针等。每个组件的质量和浓度直接影响 PCR 扩增的效率和准确性。

主要反应组分：

• 2× Master Mix：包含 DNA 聚合酶、dNTPs、缓冲液、Mg²⁺ 离子等。

• 引物：根据目标基因设计的特异性引物，通常浓度为 10 μM。

• 荧光染料或探针：如 SYBR Green 或 TaqMan 探针，通常浓度为 0.4 μL/20 μL 反应体系。

• 模板 DNA：包括从细胞、组织、或病毒样本中提取的 DNA 或 cDNA。

三、实时定量 PCR 实验的步骤与配置

1. 实验前的准备

设备启动与校验

• 开机：连接设备电源，启动 FQD-33A 或其他 PCR 仪器，并确保设备正常工作。

• 软件设置：在实验控制软件中输入实验条件，设置反应体系、实验程序和数据采集方案。

试剂与样品准备

• PCR 试剂准备：按照实验设计准备所需的 PCR 试剂。通常需要 2× Master Mix、引物、荧光染料或探针等。

• 样品准备：提取目标样本的 DNA 或 RNA，并根据需要进行反转录合成 cDNA。确保模板浓度适当。

反应体系配置

• 配置反应体系时，精确配比试剂和样品的量，确保最终反应体系的体积、浓度适合扩增反应。标准的 PCR 反应体系配置为 20 μL，其中：

• 10 μL 2× Master Mix

• 0.4 μL 上游引物（10 μM）

• 0.4 μL 下游引物（10 μM）

• 0.4 μL 荧光染料或探针

• 1-2 μL 样品模板（DNA 或 cDNA）

• 无核酸酶水补足至 20 μL

2. PCR 程序设置与优化

预变性

• 温度：95℃，时间为 3 分钟，确保模板完全解链并激活 DNA 聚合酶。

扩增循环条件

• 变性：95℃，10 秒，完全解链双链 DNA。

• 退火：通常设定为 50℃ 至 65℃，30 秒，使引物与目标 DNA 结合。

• 延伸：72℃，30 秒，用于 DNA 聚合酶延伸 DNA 链。

循环次数

• 一般设置为 30-40 次循环，具体根据样品的浓度和实验需要进行调整。

熔解曲线分析（可选）

• 温度范围：65℃ 至 95℃，每步升温 0.5℃，实时采集荧光信号，用于分析扩增产物的特异性。

3. 数据采集与分析

扩增曲线分析

• 扩增曲线是实时荧光定量 PCR 最重要的数据之一，它反映了 PCR 扩增过程中的荧光信号变化。通过解读扩增曲线，可以判断 PCR 反应的效率、特异性等。

Ct 值的计算

• Ct 值 是荧光信号首次达到设定阈值时所对应的循环数。通过计算每个样品的 Ct 值，确定样品中目标基因的相对浓度。

标准曲线法

• 在绝对定量实验中，使用已知浓度的标准品，测量其 Ct 值，绘制标准曲线。通过标准曲线，可以计算未知样品中目标基因的浓度。

相对定量法

• 通过比较目标基因与内参基因的表达量，计算相对表达量。通常使用 ΔCt 或 ΔΔCt 法进行计算。

四、实时定量 PCR 的优化策略

1. 引物优化

引物设计是 PCR 实验中的关键步骤。合理的引物设计能够提高反应的特异性和扩增效率。

引物设计要点：

• 引物长度：通常选择 18-30 个碱基的引物。

• GC 含量：一般应控制在 40%-60% 之间，过高或过低的 GC 含量都会影响扩增效率。

• Tm 值：引物的 Tm（熔解温度）应尽量相近，以确保在退火步骤中均能有效结合。

• 避免二聚体与发夹结构：引物设计时要避免形成二聚体或发夹结构，这会影响扩增效率。

2. 模板浓度优化

模板浓度的过低会导致扩增信号微弱，过高则可能抑制 PCR 反应。通常模板浓度应保持在适当范围内，一般为 1 ng/μL 至 100 ng/μL。

优化方法：

• 对于低浓度模板，增加模板量。

• 对于高浓度模板，可通过稀释来调整。

3. Mg²⁺ 离子浓度优化

Mg²⁺ 离子对 DNA 聚合酶的活性至关重要。Mg²⁺ 浓度过低会导致扩增效率低，而过高则可能导致非特异性扩增产物。

优化方法：

• Mg²⁺ 浓度通常设置在 1.5 mM 至 3.0 mM 之间，根据实验需要进行调整。

4. 退火温度优化

退火温度对 PCR 的特异性有重要影响。退火温度过低，可能导致引物与非目标 DNA 结合；退火温度过高，可能导致引物无法与模板结合。

优化方法：

• 根据引物的 Tm 值设置退火温度，通常比 Tm 值低 3℃ 至 5℃。

五、常见问题及解决方案

1. 无扩增信号

• 原因：模板浓度过低、试剂失效、PCR 条件不当。

• 解决方法：检查模板浓度，确保反应试剂的新鲜与有效性，优化 PCR 条件。

2. 扩增曲线异常

• 原因：引物设计不合理、PCR 条件设置不合适。

• 解决方法：优化引物设计，调整退火温度和扩增循环次数。

3. 非特异性扩增

• 原因：低退火温度或引物设计不合理。

• 解决方法：增加退火温度，优化引物设计，确保 PCR 反应的特异性。

4. 熔解曲线异常

• 原因：非特异性扩增产物或引物二聚体。

• 解决方法：提高退火温度，优化引物设计，减少引物二聚体的形成。

六、总结

实时定量 PCR 技术在基因定量分析、基因表达研究、基因突变检测等领域具有广泛应用。FQD-33A 等实时荧光定量 PCR 仪为科学研究和临床诊断提供了高效、精确的技术支持。通过合理的实验配置、优化反应条件和数据分析方法，用户可以获得准确可靠的实验结果，进一步推动生物学研究和疾病诊断的发展。