一、引言

博日 FQD-16A 实时荧光定量 PCR 仪是基于实时荧光定量 PCR（qPCR）技术的高精度核酸检测仪器，广泛应用于基因定量、基因突变检测、病原体检测等领域。实时荧光定量 PCR 技术的核心在于实时监测扩增过程中产生的荧光信号，通过荧光强度的变化来定量分析目标基因的浓度。FQD-16A 的工作原理基于该技术，利用其高灵敏度的荧光检测系统和精密的温控系统，确保实验的准确性和可靠性。

本篇将详细介绍博日 FQD-16A 实时荧光定量 PCR 仪的工作原理，重点包括 PCR 扩增过程中的荧光信号检测、数据采集与分析、反应条件的优化等，以帮助用户更好地理解和应用这一高效、精准的核酸检测工具。

二、实时荧光定量 PCR（qPCR）工作原理

1. PCR 扩增原理

PCR（聚合酶链式反应）是一种广泛应用于核酸扩增的技术。其基本原理是通过热循环的方式，利用 DNA 聚合酶在一定温度条件下合成新的 DNA 链，从而实现对特定 DNA 片段的复制。

PCR 过程包括三个基本步骤：

• 变性（Denaturation）：加热使双链 DNA 分开，生成单链模板。

• 退火（Annealing）：温度降低，使引物与模板 DNA 结合。

• 延伸（Extension）：DNA 聚合酶在合适的温度下进行 DNA 合成，扩增目标序列。

传统 PCR 仅用于检测目标基因的有无，而实时荧光定量 PCR（qPCR）通过在扩增过程中实时监测荧光信号的变化，使得目标基因的定量分析成为可能。

2. 实时荧光检测原理

实时荧光定量 PCR（qPCR）技术通过引入荧光染料或探针来监测 PCR 扩增过程中 DNA 产物的累积。荧光信号的强度与 DNA 产物的数量成正比，随着 PCR 扩增的进行，荧光信号逐渐增强。FQD-16A 配备的荧光检测系统能够精确记录每一个循环的荧光信号变化，从而实时监测扩增过程，最终获得目标基因的定量信息。

荧光染料与探针的工作原理

• SYBR Green：SYBR Green 是一种常用的荧光染料，它能够与双链 DNA 特异性结合。在 PCR 扩增过程中，随着扩增产物的增加，SYBR Green 与双链 DNA 结合，产生荧光信号。荧光信号的强度与扩增产物的数量成正比。

• TaqMan 探针：TaqMan 探针是另一种常用的荧光探针，通常由一个荧光基团和一个淬灭基团构成。探针的设计是针对目标序列的特异性，在 PCR 扩增过程中，荧光基团与淬灭基团分开，释放出荧光信号。由于探针仅在特定序列与其结合时才产生荧光，因此 TaqMan 探针法具有更高的特异性。

3. 荧光信号与 Ct 值的关系

实时荧光定量 PCR 的核心数据是 Ct 值（循环阈值）。Ct 值是荧光信号首次超过设定阈值所对应的 PCR 循环数。Ct 值与目标基因的初始浓度成反比，Ct 值越小，表示目标基因的初始浓度越高。因此，通过分析 Ct 值，可以定量测定样品中目标基因的浓度。

FQD-16A 通过实时监测每个 PCR 循环中的荧光信号变化，精确计算出 Ct 值，从而提供可靠的定量数据。

三、FQD-16A 的工作原理与核心组件

1. 光学系统

FQD-16A 配备了高灵敏度的光学系统，用于实时监测扩增过程中荧光信号的变化。其光学系统的核心包括：

• 激光光源：用于激发荧光染料或探针释放荧光信号。

• 光谱探测器：用于捕获和分析荧光信号，识别不同荧光染料或探针发出的信号。

• 滤光片：用于滤除不相关的信号，仅检测目标荧光信号。

通过这些组件，FQD-16A 能够实时、准确地收集荧光信号，为数据分析提供高质量的原始数据。

2. 温控系统

FQD-16A 配备高精度的温控系统，确保 PCR 反应在严格的温度条件下进行。其温控系统的精度和稳定性对于 PCR 反应至关重要。FQD-16A 的温控系统能够快速准确地实现以下温度设置：

• 变性温度：通常设为 95℃，使 DNA 双链分开。

• 退火温度：一般设为 50℃ 至 65℃，使引物与模板结合。

• 延伸温度：通常设为 72℃，促进 DNA 聚合酶合成新的 DNA 链。

这些温度条件的精确控制，保证了扩增反应的高效性和特异性。

3. 软件控制与数据处理

FQD-16A 配备先进的软件控制系统，能够自动设置实验参数，控制反应过程，实时采集数据并生成报告。软件系统具备强大的数据处理功能，可以实时显示扩增曲线、熔解曲线等实验数据，并提供详细的实验结果报告。软件还支持多种数据分析方法，如标准曲线法、相对定量法等，帮助用户快速分析实验结果。

四、FQD-16A 实验过程中的数据采集与分析

1. 数据采集

在实验过程中，FQD-16A 会实时监测每个循环中的荧光信号变化。通过荧光信号的变化，软件能够绘制扩增曲线，并计算出每个样品的 Ct 值。实验结束后，FQD-16A 会自动绘制标准曲线、熔解曲线等，并生成数据报告。

2. 数据分析

FQD-16A 提供了多种数据分析方法，以帮助用户解读实验结果。常见的数据分析方法包括：

• 标准曲线法：通过使用已知浓度的标准品，绘制标准曲线，计算样品中的目标基因浓度。

• 相对定量法：通过比较目标基因与内参基因的表达差异，计算目标基因的相对表达量。

标准曲线法分析：

标准曲线法需要使用一系列已知浓度的标准品，测量其 Ct 值，绘制标准曲线。标准曲线的斜率和截距可以帮助计算样品中目标基因的浓度。

相对定量法分析：

相对定量法通过计算 ΔCt 或 ΔΔCt 值来进行基因表达的定量分析。ΔCt 是目标基因与内参基因 Ct 值的差值，ΔΔCt 是实验组与对照组之间 ΔCt 值的差值。

3. 实验结果报告

FQD-16A 软件能够根据实验数据自动生成详细的实验报告，报告内容包括：

• 扩增曲线

• 标准曲线（对于绝对定量实验）

• 熔解曲线

• Ct 值及目标基因浓度

报告可以导出为 Excel、PDF 或图像文件，便于存档和进一步分析。

五、实验结果的优化与常见问题

1. 扩增曲线异常

• 原因：引物设计不合适、反应体系不适、PCR 条件不合适等。

• 优化建议：优化引物设计，调整 PCR 条件，确保模板质量良好。

2. 非特异性扩增

• 原因：低退火温度或引物设计不合理。

• 优化建议：增加退火温度，使用特异性较高的引物，并通过熔解曲线分析确认产物特异性。

3. 低灵敏度或无扩增信号

• 原因：模板浓度过低、反应体系问题。

• 优化建议：增加模板浓度，检查试剂和反应条件。

4. 熔解曲线异常

• 原因：非特异性扩增产物或引物二聚体。

• 优化建议：优化引物设计，使用更高特异性的探针，增加退火温度。

六、总结

博日 FQD-16A 实时荧光定量 PCR 仪通过精确的温控系统和高灵敏度的荧光检测系统，为核酸检测提供了高效、可靠的平台。了解其工作原理及数据分析方法，可以帮助用户更好地设置实验条件、优化反应体系，并获得准确的实验结果。在基因表达分析、病原体检测、基因突变检测等多个领域，FQD-16A 都能够提供强大的实验支持。