一、引言
博日 FQD-16A 实时荧光定量 PCR 仪作为高精度、高灵敏度的 PCR 仪器，广泛应用于基因表达分析、基因突变检测、病原体检测及转基因检测等领域。在这些应用中，实时荧光定量 PCR（qPCR）技术通过实时监测扩增过程中产生的荧光信号，能够精确检测和定量样本中的核酸含量。荧光检测是 qPCR 的核心技术之一，荧光信号的变化与 PCR 反应的进展成正比，通过荧光信号的实时监测，可以获得关于目标核酸浓度的准确信息。
本文将详细介绍博日 FQD-16A 实时荧光定量 PCR 仪的荧光检测原理、过程及应用，重点阐述如何通过荧光信号实时监测 PCR 扩增过程，如何选择适当的荧光染料和探针，并结合实际实验数据解读荧光信号，帮助用户更好地利用 FQD-16A 进行高效的核酸检测。
二、荧光检测原理
1. 实时荧光定量 PCR（qPCR）原理
实时荧光定量 PCR 是一种能够实时监测 PCR 扩增过程的技术，其基本原理是利用荧光染料或荧光探针与 DNA 产物结合，监测荧光信号随扩增产物增加的变化。随着扩增反应的进行，荧光信号的强度与产物量成正比。通过采集每个扩增周期的荧光信号变化，可以获得定量的基因信息。
荧光信号与扩增产物的关系
在 PCR 扩增过程中，荧光信号随着 DNA 产物的积累而逐步增强。
设备通过设置阈值（Threshold）来定义荧光信号的“显著增加”点，这一时刻的循环数称为 Ct 值（循环阈值）。
Ct 值 是目标基因初始浓度的反比：Ct 值越小，说明初始模板浓度越高。
2. 荧光染料与探针的选择
实时荧光定量 PCR 中使用的荧光信号来源有两种：荧光染料和荧光探针。它们分别有不同的工作原理和应用场景。
荧光染料（如 SYBR Green）
原理：SYBR Green 等荧光染料与双链 DNA 结合后，在紫外光照射下发出强烈的荧光信号。随着扩增产物的增加，荧光信号逐渐增强。
优点：使用简单、成本较低，无需设计探针，适用于多种样本。
缺点：无法区分非特异性产物或引物二聚体，因此需要通过熔解曲线分析来验证产物的特异性。
荧光探针（如 TaqMan 探针）
原理：探针是一种带有荧光基团和淬灭基团的短片段 DNA。探针在 PCR 扩增过程中与目标 DNA 序列结合，聚合酶通过其 5' 到 3' 的外切酶活性剪切探针，释放荧光信号。此信号强度与扩增产物量成正比。
优点：具有高度特异性，能够有效区分特异性产物和非特异性扩增产物。
缺点：需要设计特异性探针，实验准备和成本较高。
三、博日 FQD-16A 荧光检测过程
1. PCR 反应体系配置
荧光检测的首要步骤是准确配置 PCR 反应体系。反应体系的组成直接影响到 PCR 扩增效果和荧光信号的强度。通常，FQD-16A 的 PCR 反应体系包括：
2× Master Mix：包含 DNA 聚合酶、dNTPs、缓冲液和 Mg²⁺ 离子。
上游和下游引物：根据目标基因设计的特异性引物，通常浓度为 10 μM。
荧光染料或探针：根据选择的检测方法（SYBR Green 或 TaqMan 探针），添加相应的荧光染料或探针。
模板：待检测样本的 DNA 或 cDNA。
反应体系配置（20 μL）示例：
| 组分 | 用量 |
|---|---|
| 2× Master Mix | 10 μL |
| 上游引物（10 μM） | 0.4 μL |
| 下游引物（10 μM） | 0.4 μL |
| 荧光染料（SYBR Green 或 TaqMan 探针） | 0.4 μL |
| 模板 DNA 或 cDNA | 1–2 μL |
| 无核酸酶水 | 补足至 20 μL |
2. 实验设置与程序配置
在 FQD-16A 软件中设置实验程序。常见的设置包括：
预变性：95℃，3 分钟，用于完全解链模板，并激活聚合酶。
扩增循环：95℃，10 秒；60℃，30 秒（荧光信号采集）；72℃，30 秒（延伸）。
循环次数：通常为 40 次，根据实验需求调整。
熔解曲线（如果使用 SYBR Green）：设置温度范围为 65℃ 至 95℃，每步升温 0.5℃，实时采集荧光信号，用于分析扩增产物的特异性。
3. 样品上机与反应启动
配置好 PCR 反应体系后，将其加入 PCR 管或 8 联管中，确保每个孔位的样品均匀分布，并放入 FQD-16A 的反应模块中。
启动 FQD-16A 软件，点击“开始实验”按钮，仪器将自动开始扩增反应，并实时监测荧光信号。
四、荧光信号的实时监测与数据采集
1. 扩增曲线分析
实时荧光定量 PCR 通过荧光信号的变化绘制扩增曲线，曲线呈“S 型”形状，反映了 PCR 反应的三个阶段：背景期、指数增长期和平台期。
背景期：未扩增产物或信号较低，荧光信号处于背景水平。
指数增长期：PCR 扩增的关键阶段，荧光信号随着扩增产物的增加呈指数级增长。
平台期：PCR 扩增接近完成，荧光信号趋于平稳。
通过监测荧光信号的变化，可以准确计算 Ct 值（循环阈值），从而推算样品中目标基因的初始浓度。
2. 熔解曲线分析
熔解曲线分析有助于评估扩增产物的特异性。在扩增完成后，FQD-16A 会自动升温，逐步解链 PCR 产物，并监测荧光信号的变化。理想情况下，扩增产物应呈现单一、尖锐的熔解峰，表示产物纯度良好。
单一熔解峰：表示扩增产物为特异性产物。
多个峰或宽峰：表明可能存在非特异性扩增产物或引物二聚体。
3. Ct 值与定量分析
Ct 值是荧光信号首次超过设定阈值所对应的循环数。Ct 值与目标基因的初始浓度成反比，Ct 值越低，表示样品中目标基因的初始浓度越高。
标准曲线法：通过使用已知浓度的标准品绘制标准曲线，推算样品中目标基因的拷贝数。
相对定量法：通过计算目标基因与内参基因的相对表达量，评估目标基因的相对表达水平。
五、常见问题及优化策略
1. 无扩增信号
原因：模板未加入、试剂失效、PCR 条件设置不当。
解决方法：检查模板和试剂的质量，重新配置反应体系，优化 PCR 条件。
2. 扩增曲线异常
原因：引物设计不合理、反应体系不合适。
解决方法：优化引物设计，调整退火温度或扩增条件。
3. Ct 值异常
原因：模板浓度过低或过高。
解决方法：调整模板量，使其适应实验要求。
4. 熔解曲线异常
原因：引物二聚体或非特异性扩增产物。
解决方法：优化引物设计，增加退火温度，确保 PCR 反应特异性。
六、总结
博日 FQD-16A 实时荧光定量 PCR 仪通过精确的荧光检测技术，提供了高灵敏度的核酸检测平台。无论是在基因表达分析、病原体检测、基因突变检测，还是在转基因检测等应用中，FQD-16A 都能提供可靠的实验结果。通过优化实验设计、配置反应体系、调整 PCR 条件，用户能够有效提高实验的准确性和稳定性。
