一、前言

博日实时荧光定量PCR仪FQD-16A是一款性能卓越的PCR分析仪器，广泛应用于基因定量、基因表达分析、病原微生物检测等多个生物医学和生物技术研究领域。实时荧光定量PCR（qPCR）技术因其高灵敏度、高精度和高特异性，成为许多分子生物学实验中的常规技术。

本文将详细介绍博日实时荧光定量PCR仪FQD-16A的实验操作流程，从实验前准备到实验数据分析，帮助用户熟练掌握如何使用该设备进行高效的PCR实验。

二、实验前准备

1. 环境要求

实验环境的设置直接影响PCR实验的稳定性与结果的准确性。使用FQD-16A进行实时荧光定量PCR实验时，实验室的温度和湿度应该保持在一定的范围内：

• 温度要求：建议实验室温度保持在18℃至30℃之间。过低或过高的环境温度可能会影响设备的性能，甚至导致实验失败。

• 湿度要求：相对湿度应保持在30%至80%之间，过高的湿度可能会对设备内部电子元件产生负面影响，且会影响试剂和样品的稳定性。

• 通风条件：保持良好的通风，避免设备过热或空气污染影响实验结果。

2. 设备安装与检查

在进行实验操作前，确保FQD-16A设备已正确安装并连接好所需的配件，如样品槽、反应板或反应管等，并通过计算机与软件连接。

• 设备位置：将设备安置在稳定的工作台上，避免震动或倾斜。确保设备周围有足够的空间，以便空气流通，避免过热。

• 电源检查：确保设备连接到稳压电源插座，避免电压波动影响设备的正常运行。

• 设备自检：在启动设备之前，进行设备自检，检查温控系统和光学系统的状态，确保设备能够正常工作。

3. 样品准备

样品的质量对PCR实验结果至关重要。以下是样品准备的步骤：

• DNA/RNA提取：根据实验需求，提取样品中的DNA或RNA。确保提取方法无污染，且提取物具有足够的浓度和纯度。

• 样品浓度测定：使用分光光度计或荧光定量仪测定DNA或RNA的浓度。通常，DNA的浓度应在10ng/µL到100ng/µL之间，RNA样品的浓度应根据实验需要确定。

三、反应体系的配置

配置合适的PCR反应体系是确保实验成功的关键。FQD-16A支持用户自定义PCR反应液的配置，以下是典型的实时定量PCR反应液的组成：

1. 核心成分

• 模板DNA：根据实验需求，使用适量的DNA模板。对于常规定量PCR，模板浓度一般为10ng/µL至100ng/µL。

• 引物：根据目标基因的序列设计合适的前向引物和反向引物。通常，引物浓度设置为0.1–1 µM。

• 荧光染料/探针：根据实验设计，选择合适的荧光染料（如SYBR Green）或荧光探针（如TaqMan探针）。荧光染料的浓度一般为1x，而探针的浓度则为50nM至200nM。

• dNTP：四种dNTP的浓度设置为200 µM，以保证DNA合成的进行。

• Mg²⁺：适量的镁离子（通常为1.5–3.0 mM）对于聚合酶的活性至关重要，过多或过少的Mg²⁺浓度都会影响PCR反应。

• 聚合酶：通常使用Taq聚合酶，浓度设置为0.5–2 U/50 µL反应液。

2. PCR反应液配制

根据实验需求，配制PCR反应液。以下是每个成分的常规配置比例：

• 1× PCR缓冲液

• 0.5-2 µM前向引物与反向引物

• 200 µM dNTP

• 1.5-3.0 mM Mg²⁺

• 1×荧光染料或适当浓度的探针

• 适量的模板DNA

• 聚合酶（如Taq聚合酶）

• PCR反应液总量根据样品数量和容器大小进行调整

四、FQD-16A的实验操作步骤

1. 反应管或反应板的选择与加载

FQD-16A支持使用96孔PCR板和384孔PCR板。选择适当的反应管或PCR板，并将PCR反应液分配到每个孔中。确保反应液的分配均匀，避免气泡或溢出。

• 反应管或板的选择：根据实验样品的数量选择合适的反应管或PCR板。如果样品较多，可以选择96孔或384孔PCR板，以提高实验效率。

• 加样操作：使用移液器精确分配反应液，确保每个孔中的样品量一致。加样时要注意避免交叉污染，建议在无尘环境下进行。

2. 实验设置与启动

• 打开设备与软件连接：启动FQD-16A设备并打开控制软件。确保设备和计算机连接正常，并进入实验操作界面。

• 设置实验参数：在软件中输入PCR反应的参数，包括温度、时间、循环次数以及荧光采集通道。确保温度和时间的设置符合目标基因的扩增要求。

• 选择PCR模式：根据实验需求选择适合的PCR模式，如常规PCR、实时定量PCR等。

• 设置循环次数：PCR的循环次数根据模板浓度、实验目标和样品量来设定，通常为30-40个循环。

• 启动实验：确保所有设置无误后，点击“开始实验”按钮，FQD-16A将自动进行PCR扩增并实时监控荧光信号变化。

五、实时监控与数据采集

1. 扩增曲线的实时监控

FQD-16A能够实时采集PCR反应中的荧光信号，并生成扩增曲线。实验过程中，设备会持续监测每个循环的荧光信号，直至反应进入平台期，荧光信号趋于平稳。

• 扩增曲线的形态：理想的扩增曲线应该是指数型上升，在阈值线上突破并达到平台期。异常的曲线可能表明PCR反应出现问题，如扩增效率低或非特异性扩增。

2. Ct值计算与结果显示

设备通过实时监控扩增曲线的变化，自动计算Ct值（循环阈值），即荧光信号首次突破设定阈值时的循环次数。FQD-16A能够实时显示各样品的Ct值，以及扩增曲线和标准曲线，帮助用户判断实验的成功与否。

• 数据展示：在实验过程中，FQD-16A会在控制软件的界面中显示每个样品的扩增曲线、Ct值及其他实时数据。用户可以直观地观察到各样品的反应进展。

3. 数据分析

实验结束后，FQD-16A的分析软件会根据扩增曲线自动计算样品中目标基因的相对或绝对表达量。用户可以选择绝对定量分析（通过标准曲线法）或相对定量分析（通过ΔΔCt法）。

• 标准曲线法：通过已知浓度的标准品生成标准曲线，计算样品中的目标基因拷贝数。

• ΔΔCt法：通过比较目标基因与内参基因的Ct值差异，计算目标基因在不同样品中的相对表达量。

六、实验数据的导出与报告生成

1. 数据导出

FQD-16A支持将实验数据导出为多种格式，包括Excel、CSV、PDF等。用户可以将计算出的Ct值、扩增曲线、标准曲线以及相对/绝对定量结果保存并用于后续分析。

• Excel导出：将实验数据导出为Excel文件，方便进行后续的数据分析和处理。

• PDF报告生成：通过FQD-16A的分析软件，用户可以生成详细的实验报告，报告包括实验条件、Ct值、扩增曲线、标准曲线图等内容。

2. 实验报告生成

FQD-16A能够自动生成标准格式的实验报告，报告包括：

• 实验设置：温度、时间、循环次数、荧光染料等参数。

• 扩增曲线：每个样品的扩增曲线图，帮助用户直观地评估实验结果。

• Ct值与定量分析结果：计算出的Ct值、标准曲线和定量结果，支持相对定量和绝对定量分析。

报告可根据需要导出为PDF或Word文档，便于存档和共享。

七、常见问题及解决方法

1. 扩增曲线异常

• 问题描述：扩增曲线偏离理想状态，出现拖尾或平台提前。

• 解决方法：

• 检查反应体系是否合适，确保引物和模板浓度适宜。

• 调整温度和时间设置，特别是退火温度和延伸时间。

• 确保使用的荧光染料或探针的浓度适中，避免过高或过低的浓度导致非特异性扩增。

2. Ct值计算异常

• 问题描述：Ct值过高或过低，导致定量结果不准确。

• 解决方法：

• 检查标准曲线是否符合预期，确保标准品的浓度范围适当。

• 调整PCR反应的循环次数和温度，确保反应在最佳状态下进行。

3. 数据导出失败

• 问题描述：无法导出实验数据或报告。

• 解决方法：

• 检查保存路径和文件格式，确保文件夹权限正常。

• 确保FQD-16A与计算机的连接稳定，必要时重启设备和软件。

八、总结

博日实时荧光定量PCR仪FQD-16A是一款功能强大的PCR设备，其精确的温控系统、灵敏的荧光检测系统和智能数据分析功能，使得用户能够高效地进行基因定量分析。在使用FQD-16A时，合理配置反应体系、设置合适的实验参数、进行数据分析并生成实验报告，能够有效确保实验结果的准确性和可靠性。通过掌握设备的操作流程和常见问题的解决方法，用户能够提升实验效率，确保高质量的科研成果。