博日实时荧光定量pcr仪FQD-16A检测流程

时间：2025-08-27

一、引言

博日 FQD-16A 实时荧光定量 PCR 仪是一款功能强大、操作简便的小型化 PCR 仪器，广泛应用于基因定量、基因表达分析、病原体检测、基因突变检测等分子生物学研究。实时荧光定量 PCR（qPCR）技术通过实时监测扩增过程中产生的荧光信号，能够精确检测和定量样本中的核酸含量。

正确的操作流程对于确保实验结果的准确性和可靠性至关重要。本文将详细介绍 博日 FQD-16A 的检测流程，包括从设备开机、试剂准备、反应体系配置、程序设置、样品上机到数据分析的各个步骤，帮助用户实现高效、精准的核酸检测。

二、设备准备与开机

1. 设备连接与电源开启

将博日 FQD-16A 实时荧光定量 PCR 仪与电源插座连接，确保电源电压稳定。
打开仪器背部的电源开关。
确保仪器与计算机的连接稳定，启动 FQD-16A 的专用软件。

2. 仪器自检与初始化

开机后，仪器会自动进行自检，检查温控模块、光学系统以及各个硬件部件是否正常工作。
自检通过后，进入实验操作界面，准备开始实验。

3. 环境条件确认

确保实验环境温度在 18℃ 至 30℃ 之间，湿度在 30% 至 70% 之间，避免强光直射与强电磁干扰。

三、试剂准备与配置

1. 试剂准备

PCR Master Mix（2×）：用于提供聚合酶、dNTPs、缓冲液、Mg²⁺ 离子等必要成分。
上游与下游引物：根据目标基因设计特异性的引物，通常浓度为 10 μM。
模板：包括 DNA 或 cDNA 样品，确保模板的质量和浓度符合实验要求。
荧光染料或探针：常用的荧光染料有 SYBR Green，或使用特异性探针如 TaqMan 探针。

2. 反应体系配置

根据实验需求配置 PCR 反应体系。以下为标准 20 μL 反应体系配置：

组分	用量
2× Master Mix	10 μL
上游引物（10 μM）	0.4 μL
下游引物（10 μM）	0.4 μL
模板 DNA	1–2 μL
无核酸酶水	补足至 20 μL

配制完成后，用轻轻混匀的方式确保试剂均匀，并将混合体系瞬时离心，去除气泡。

3. 样品准备

提取样品中的 DNA 或 RNA，并在必要时进行反转录合成 cDNA。模板浓度通常为 1–2 μL，具体浓度根据实验要求进行调整。

四、程序设置与实验启动

1. 选择实验模式

根据实验需求，在 FQD-16A 软件中选择合适的实验模式：

定性 PCR：用于检测目标基因的存在与否。
定量 PCR：用于定量分析样本中目标基因的拷贝数。
多重 PCR：用于同时检测多个目标基因。
熔解曲线分析：用于检测扩增产物的特异性。

2. 设定实验参数

在软件中设置相应的实验参数：

预变性：通常设置为 95℃，3 分钟，确保模板完全解链并激活聚合酶。
扩增循环：常规设置为 95℃，10 秒；60℃，30 秒，40 次循环。根据不同引物和模板的要求，可以适当调整退火温度和循环次数。
延伸：一般设置为 72℃，30 秒，用于扩增产物。
熔解曲线（如需要）：设置温度范围为 65℃ 至 95℃，每步升温 0.5℃，实时采集荧光信号，帮助分析扩增产物的特异性。

3. 通道选择

根据所使用的荧光染料或探针选择合适的荧光通道。例如，使用 SYBR Green 时，选择 FAM 通道；使用 TaqMan 探针时，选择相应的探针通道。

五、样品上机与反应启动

1. 样品加载

将配置好的 PCR 反应体系小心加入到 PCR 管中，确保每个孔位上的反应管没有气泡，且与反应模块接触良好。
将 PCR 管放入 FQD-16A 的反应模块中，并确保盖板关闭良好，避免液体蒸发。

2. 启动实验

在 FQD-16A 软件中确认所有实验参数设置无误后，点击“启动实验”按钮，仪器将自动开始执行预设的扩增程序。
在实验过程中，仪器将实时监测荧光信号，绘制扩增曲线，并记录数据。

六、数据采集与分析

1. 扩增曲线分析

实验过程中，软件会实时绘制扩增曲线。理想的扩增曲线呈“S 型”，并在指数增长期呈现直线，随后进入平台期。
Ct 值计算：实验结束后，软件会自动计算每个样品的 Ct 值（循环阈值）。Ct 值与模板初始浓度成反比，Ct 值越低，初始浓度越高。

2. 熔解曲线分析

在扩增完成后，FQD-16A 会自动进行熔解曲线分析。通过逐步升温，记录扩增产物的熔解过程。理想情况下，熔解曲线应呈现单一的尖锐峰，表示扩增产物是特异性的。
若熔解曲线显示多个峰或宽峰，说明扩增产物中可能存在非特异性产物或引物二聚体。

3. 数据导出与报告生成

实验完成后，FQD-16A 软件将自动生成实验报告，包括扩增曲线、熔解曲线、Ct 值及相应的定量结果。
用户可以将数据导出为 Excel、PDF 或图像格式，便于后续分析、存档或报告生成。

七、常见问题及解决方案

1. 无扩增信号

原因：模板未加入、试剂失效或反应条件不当。
解决方法：检查模板和试剂的质量，重新配置反应体系，确保反应条件合适。

2. 扩增曲线异常

原因：引物设计不合理、反应体系不当或模板质量差。
解决方法：优化引物设计，调整 PCR 条件，确保模板质量良好。

3. Ct 值异常

原因：模板浓度过低或过高，PCR 条件不合适。
解决方法：调整模板量，优化 PCR 条件，确保反应体系的准确性。

4. 熔解曲线异常

原因：非特异性扩增产物或引物二聚体。
解决方法：提高退火温度，优化引物设计，调整反应条件。

八、实验结束后的操作

1. 取样与清理

实验结束后，打开加热模块盖板，取出 PCR 管。根据需要将样品保存或丢弃。
清理反应模块，使用无尘布轻轻擦拭，避免污染或液体渗入设备。

2. 设备清洁与维护

每次实验后，需定期检查 FQD-16A 的光学系统、温控模块和反应模块，保持设备的清洁和良好运行状态。
定期对仪器进行维护，检查散热系统、光学系统是否正常工作，确保仪器长期稳定运行。

九、总结

博日 FQD-16A 实时荧光定量 PCR 仪通过精准的温控与高灵敏度的荧光检测系统，提供了一个可靠、高效的核酸检测平台。通过详细的操作步骤，从设备开机到实验结束，用户可以确保实验结果的高效性与准确性。及时优化实验条件、解决常见问题，并进行合理的数据分析，是实现高质量实验结果的关键。