一、引言

博日 FQD-16A 实时荧光定量 PCR 仪广泛应用于基因表达分析、基因突变检测、疾病诊断及病原体检测等多个领域。在实验完成后，如何正确判读实验结果是确保实验数据准确性和可靠性的关键。结果判读包括对扩增曲线、熔解曲线及定量数据的解读。实时荧光定量 PCR 技术通过检测每个扩增周期的荧光信号来判断目标核酸的含量，且能够在实验过程中实时获得数据。通过对这些数据的正确解读，实验人员可以获得关于样品中目标基因的定性或定量信息。

本文将详细介绍博日 FQD-16A 实时荧光定量 PCR 仪的结果判读方法，重点讲解扩增曲线与熔解曲线的解读、定量分析的步骤，以及如何处理常见问题，优化结果分析。

二、结果判读的基本原理

实时荧光定量 PCR（qPCR）技术通过荧光信号的累积，实时监测 PCR 扩增产物的增加。在每个循环结束后，荧光信号的强度与扩增产物的量成正比。通过这些荧光信号，软件能够自动生成扩增曲线和熔解曲线，并计算相关的 Ct 值和其他定量指标。

1. 扩增曲线分析

扩增曲线是通过实时监测荧光信号的强度变化来反映 PCR 扩增反应的进展。每个样品的扩增曲线应该呈现“S 型”形态，其中包括：

• 指数增长期：反应初期，荧光信号随扩增产物的增加呈指数增长。

• 平台期：当大部分模板已被扩增，荧光信号趋于平稳。

• 背景噪声期：未扩增的样品或者阴性对照，荧光信号低，无法突破阈值。

2. 熔解曲线分析

熔解曲线分析是用于评估扩增产物特异性的一种方法。通过对扩增后的产物逐步升温，监测荧光信号的变化。熔解曲线的特点是随着温度升高，双链 DNA 会解链，荧光信号下降。理想情况下，特异性扩增产物会呈现单一的熔解峰，表示扩增产物是纯净且特异的。

3. Ct 值与定量分析

Ct 值（Cycle Threshold）是荧光信号首次超过背景噪声并达到设定阈值的循环次数。Ct 值与目标基因的初始浓度成反比，Ct 值越小，目标基因的初始浓度越高。定量 PCR 可以根据标准曲线法或相对定量法，推算样品中目标基因的具体拷贝数。

三、扩增曲线的解读

1. 标准扩增曲线的形态

理想的扩增曲线呈“S 型”，并应符合以下特征：

• 指数增长期：扩增产物快速增加，荧光信号线性上升。

• 平台期：荧光信号稳定，反应几乎完成。

• 背景噪声期：荧光信号接近零，未扩增产物的对照。

2. Ct 值的判定

• 高效扩增：Ct 值低，表示样品中目标基因的初始浓度高。

• 低效扩增：Ct 值较高，表示样品中目标基因的初始浓度低。可能是因为模板浓度过低，反应体系不充分或引物设计不合适。

• 无扩增：如果在预设的循环数内未出现显著的荧光信号上升，说明样品中没有目标基因或反应失败。

3. 常见问题及分析

• 扩增曲线拖尾或弯曲：可能由引物二聚体或模板质量问题引起。需要重新优化引物或提高模板质量。

• 扩增曲线不对称或平台期过早：可能是由于 PCR 条件设置不合理，导致扩增反应提前进入平台期。可以通过调整退火温度、延伸时间或优化反应体系进行改进。

四、熔解曲线的解读

1. 熔解曲线的形态

理想的熔解曲线应该呈现单一尖锐的熔解峰，表示扩增产物是纯净的，未出现非特异性扩增或引物二聚体。熔解峰的位置（熔解温度，Tm）与扩增产物的序列和长度相关。

2. 异常的熔解曲线

• 多峰熔解曲线：通常表示扩增产物不纯，可能存在引物二聚体或非特异性扩增产物。这种情况需要重新设计引物或优化 PCR 条件。

• 宽峰：宽峰可能表示扩增产物的异质性，部分产物可能有不同的熔解温度。

• 熔解峰偏移：若熔解峰发生明显的温度偏移，可能是由于反应体系中的Mg²⁺ 浓度不适当，或者引物设计不合理。

3. 优化熔解曲线

• 提高退火温度：如果熔解曲线显示非特异性产物，可以尝试提高退火温度以增强引物的特异性。

• 使用添加剂：如 DMSO 或 BSA，可以减少样品中可能存在的抑制性成分，改善扩增特异性。

五、定量分析方法

1. 绝对定量法

绝对定量法通过制作标准曲线，利用已知浓度的标准品（通常为已知拷贝数的 DNA 样本）来计算未知样品中的目标基因的拷贝数。标准曲线法是根据一系列不同浓度的标准品，测量它们的 Ct 值，绘制标准曲线，通过 Ct 值与浓度的关系来计算样品中目标基因的浓度。

标准曲线的制作：

• 配置不同浓度的标准品。

• 测量每个标准品的 Ct 值。

• 绘制 Ct 值与对数浓度的关系曲线，得到标准曲线。

• 使用标准曲线计算未知样品的目标基因浓度。

2. 相对定量法

相对定量法用于比较目标基因与内参基因的表达差异。通过计算 ΔCt 或 ΔΔCt 值，得出目标基因的相对表达量。

ΔCt 方法：

• ΔCt = Ct（目标基因） - Ct（内参基因）

• ΔCt 值越小，表示目标基因的表达量越高。

ΔΔCt 方法：

• ΔΔCt = ΔCt（实验组） - ΔCt（对照组）

• ΔΔCt 值用于比较实验组和对照组之间的表达差异，计算相对表达量。

3. 常见问题与优化

• 标准曲线不线性：如果标准曲线显示不规则或非线性，可能是由于标准品浓度过宽、模板降解或反应体系不均匀。可以通过优化标准品的浓度范围和反应条件来改进。

• 相对定量结果不稳定：可能是由于内参基因不稳定，建议选择稳定表达的内参基因。

六、数据结果的报告与导出

1. 数据报告生成

实验结束后，FQD-16A 软件会自动生成实验结果报告，报告包括：

• 扩增曲线图：显示各样本的扩增曲线、Ct 值。

• 标准曲线图（绝对定量）：显示标准品的 Ct 值与浓度的关系曲线。

• 熔解曲线图：显示扩增产物的熔解特征，帮助判断产物的特异性。

• 定量分析结果：包括目标基因的 Ct 值、相对定量结果或绝对定量结果。

2. 数据导出

实验数据可以通过软件导出为多种格式，包括 Excel、PDF 或 图片 等，便于进一步分析、存档或报告生成。

七、总结

博日 FQD-16A 实时荧光定量 PCR 仪提供了强大的数据采集和分析功能，使得用户能够快速、准确地进行基因定量分析。通过对扩增曲线、熔解曲线和定量分析数据的精确解读，研究人员能够获得高质量的实验数据，确保研究结果的可靠性和准确性。正确判读实验结果并及时解决实验中出现的问题，是确保 FQD-16A 实验成功的关键。