一、引言

博日 FQD-16A 实时荧光定量 PCR 仪是一款高性能的实验设备，广泛应用于基因定量分析、基因表达检测、疾病诊断、病原体检测等领域。为了确保实验的顺利进行，正确的操作流程和规范的运行步骤至关重要。

FQD-16A 实时荧光定量 PCR 仪集成了高效的温控系统、精密的光学系统和简便的操作软件，使得用户能够轻松进行核酸检测与分析。为了确保实验结果的准确性和可靠性，本文将详细介绍博日 FQD-16A 的运行步骤，包括从设备开机到实验结束后的所有操作流程，并提供一些常见问题的解决方案。

二、设备开机与初始化

1. 开机步骤

• 电源连接：确保设备电源线连接稳固，插座电压在 100V 到 240V 之间。

• 主机电源开启：按下设备背部的电源开关，确保设备开始工作。

• 软件启动：通过电脑连接设备，打开 FQD-16A 的专用软件，确保电脑与仪器之间的通信正常。

• 自检功能：设备开机后会进行自检，确认所有系统功能正常。用户可根据设备显示的状态信息，检查仪器的工作状态。

2. 设备状态确认

开机后，检查显示屏上是否显示正常的仪器状态。若显示异常，检查电源和连接是否正常。自检完成后，仪器会提示进入实验操作界面，准备进行实验。

三、实验前准备

1. 试剂准备

确保所用试剂新鲜且符合实验要求。常见的试剂包括：

• PCR Master Mix（2×）：含有 DNA 聚合酶、dNTPs、缓冲液、Mg²⁺ 离子等。

• 引物：根据目标基因设计合适的上游和下游引物，确保其浓度为 10 μM。

• 模板：DNA 或 cDNA 样品，确保模板的质量和浓度符合实验需求。

• 荧光染料/探针：根据实验类型选择适合的荧光染料（如 SYBR Green）或探针（如 TaqMan 探针）。

2. 反应体系配置

根据实验需要配置 PCR 反应体系。常见的 20 μL 反应体系配置如下：

• 配置完毕后，用轻轻混匀的方式确保试剂均匀，并将混合体系瞬时离心，去除气泡。

3. 样品准备

确保样品的浓度符合实验要求。对于 DNA 模板，常见的浓度为 10–100 ng/μL，具体浓度根据实验需求调整。对于 RNA 样品，需要先进行反转录实验生成 cDNA。

四、程序设置

1. 选择实验模式

根据实验需求，FQD-16A 提供不同的实验模式供用户选择，包括：

• 定性 PCR：用于检测目标是否存在。

• 定量 PCR：用于测定目标基因的拷贝数，适用于基因表达分析。

• 多重 PCR：用于同时检测多个目标。

• 熔解曲线分析：用于验证扩增产物的特异性。

在软件界面中选择相应的实验模式，进入设置页面。

2. 设置实验参数

根据实验的具体要求，设置以下参数：

• 预变性条件：一般为 95℃，3 分钟。此步骤用于激活 DNA 聚合酶，并充分解链模板。

• 循环条件：包括变性（95℃，10 秒）、退火（60℃，30 秒）、延伸（72℃，30 秒）。根据引物的特性，退火温度可适当调整。

• 循环次数：一般为 40 次，视实验需要调整。

• 熔解曲线设置：设定 65℃ 至 95℃ 的温度范围，逐步升温并实时记录荧光信号，用于检测产物的特异性。

3. 通道选择

选择合适的荧光通道。对于 SYBR Green 荧光染料，一般选择 FAM 通道；对于 TaqMan 探针法，根据探针的标记选择适当的通道。

五、样品上机

1. 样品加载

将配置好的 PCR 反应体系小心加入到 PCR 管或 8 联管中，确保反应体系充分混合，避免气泡影响荧光信号的采集。确保每个孔位上的反应管与反应模块接触良好，以保证温控的均匀性。

2. 加热模块盖板关闭

确认所有 PCR 管已经正确放置在反应模块中后，关闭加热模块盖板。盖板应当与反应管保持密封，以确保温控系统有效防止液体蒸发。

六、实验运行

1. 启动实验

在 FQD-16A 软件中设置好所有实验参数后，点击“开始实验”按钮，仪器将自动执行所设置的程序。FQD-16A 会实时监测 PCR 扩增过程中产生的荧光信号，并绘制扩增曲线。

2. 实时监控

在实验进行过程中，FQD-16A 软件会实时显示荧光信号的变化。用户可以随时监控实验进展，查看各样本的 Ct 值、扩增曲线和标准曲线。软件也会显示阈值线和其他数据，使得数据的解读更加直观。

3. 熔解曲线分析（如需要）

如果选择了熔解曲线分析，FQD-16A 会在扩增结束后自动升温，实时记录产物的熔解过程，并绘制熔解曲线。熔解曲线可以帮助检测扩增产物的特异性，确保 PCR 产物没有杂交或非特异性扩增。

七、数据分析与结果解读

1. 扩增曲线分析

实验结束后，FQD-16A 软件会自动生成扩增曲线。通过曲线上的 Ct 值，用户可以获得样品中目标基因的相对或绝对定量结果。Ct 值越低，表示模板中目标基因的初始拷贝数越高。

标准曲线法：

对于定量 PCR，通过绘制标准曲线来计算样品中的拷贝数。标准曲线的制作需要使用已知浓度的标准品进行验证。标准曲线通常为线性关系，斜率和截距可以用来计算样品的浓度。

2. 熔解曲线分析

熔解曲线的结果可以帮助分析扩增产物的特异性。单一尖锐的熔解峰表示扩增产物是特异性的，若出现多个峰或宽峰，表明可能存在非特异性产物或引物二聚体。

3. 数据导出与报告生成

实验结束后，FQD-16A 提供数据导出的功能，支持导出为 Excel、PDF 或图像等格式。实验数据包括 Ct 值、扩增曲线、标准曲线、熔解曲线等，可以生成详细的实验报告，用于数据分析或存档。

八、实验结束后的操作

1. 取样与清理

实验完成后，打开加热模块盖板，取出 PCR 管。根据实验需求，可以保存样品以供进一步分析或丢弃。

2. 设备清洁

实验结束后，应清洁 FQD-16A 仪器的外部和反应模块。使用无尘布擦拭仪器外表，避免液体渗入。对于光学系统和反应模块，应定期进行清洁和维护，以保持仪器的最佳性能。

九、常见问题与解决方法

1. 无扩增信号

• 原因：模板未加入、试剂失效或反应条件不合适。

• 解决方法：检查模板和试剂的质量，确认反应体系配置是否正确，并优化 PCR 条件。

2. 扩增曲线异常

• 原因：PCR 体系配置不当、引物设计不合理。

• 解决方法：优化引物设计，调整反应体系，确保 PCR 条件合理。

3. 熔解曲线异常

• 原因：非特异性扩增产物或引物二聚体。

• 解决方法：优化引物设计，调整退火温度，必要时增加添加剂来提高扩增的特异性。

十、总结

博日 FQD-16A 实时荧光定量 PCR 仪提供了高效、准确、灵活的核酸检测解决方案。通过正确的操作步骤，从设备开机到实验结束后处理，用户可以轻松获得高质量的实验数据。了解并遵循规范的操作流程、数据分析方法及常见问题的解决方案，不仅能提升实验的准确性，还能确保设备的长期稳定运行。