博日实时荧光定量pcr仪FQD-16A检测方法

时间：2025-08-27

一、引言

博日 FQD-16A 实时荧光定量 PCR 仪广泛应用于基因定量、基因表达分析、病原体检测、基因突变检测、转基因检测等领域。实时荧光定量 PCR（qPCR）技术作为核酸检测的核心技术之一，凭借其高灵敏度、高特异性和高重复性，已成为现代分子生物学研究和临床诊断中的重要手段。通过实时监测 PCR 反应过程中产生的荧光信号，qPCR 技术不仅能够定量分析目标核酸的含量，还能评估 PCR 产物的特异性和质量。

本文将详细介绍博日 FQD-16A 实时荧光定量 PCR 仪的检测方法，包括 qPCR 的基本原理、操作步骤、实验设置、数据分析方法及常见问题的解决方案，帮助实验人员更好地理解和掌握该技术，确保实验结果的准确性和可靠性。

二、实时荧光定量 PCR 检测原理

1. 基本原理

实时荧光定量 PCR（qPCR）技术基于传统 PCR 技术，结合荧光探针和染料实时监测扩增反应中产生的荧光信号。每个循环结束后，荧光信号强度与扩增产物的数量成正比，从而实现对目标核酸浓度的定量分析。

qPCR 的关键步骤是通过监测反应中释放的荧光信号，推算出样本中目标基因的初始数量。实时荧光 PCR 通常使用两种不同的检测方法：

SYBR Green 法：利用染料 SYBR Green 与双链 DNA 结合，随着 PCR 扩增产物的增加，荧光信号逐渐增强。
探针法：通过特异性探针与目标 DNA 的结合，探针上的荧光基团和淬灭基团在扩增过程中释放荧光信号，能够更高精度地检测扩增产物。

2. 扩增过程中的荧光信号变化

在每个 PCR 循环结束后，荧光信号的强度会增加，随着目标核酸的扩增，荧光信号的强度也逐渐增强。当荧光信号超过设定的阈值时，仪器会记录这个循环点，称为阈值循环数（Ct 值）。Ct 值的大小与模板的初始浓度成反比，Ct 值越小，代表目标基因的初始浓度越高。

3. 实时监测和数据采集

实时荧光定量 PCR 的核心特征是能够在每个 PCR 循环结束时实时监测荧光信号。通过专门的荧光检测系统，FQD-16A 实时记录每个循环中产生的荧光信号，从而在实验过程中生成扩增曲线。实验结束后，通过荧光信号的强度变化，可以计算出样本中目标核酸的定量结果。

三、FQD-16A 检测方法操作步骤

1. 实验准备

1.1 试剂准备

2× Master Mix：包含 DNA 聚合酶、dNTPs、缓冲液等成分。
上游和下游引物：根据目标基因设计引物，一般浓度为 10 μM。
荧光染料或探针：选择合适的染料（如 SYBR Green）或 TaqMan 探针。
模板：从样本中提取的 DNA 或 cDNA。

1.2 仪器检查

确认 FQD-16A 仪器已正确连接并开机，检查反应模块和光学系统是否工作正常。
启动仪器上的软件，进行自检，确保设备能够正常运行。

2. 反应体系配置

在实验开始之前，配置 PCR 反应体系是确保实验成功的关键步骤。以下是以 20 μL 反应体系为例的标准配置：

SYBR Green PCR 反应体系（20 μL）

组分	用量
2× Master Mix	10 μL
上游引物（10 μM）	0.4 μL
下游引物（10 μM）	0.4 μL
模板 DNA 或 cDNA	1–2 μL
无核酸酶水	补足至 20 μL

TaqMan 探针 PCR 反应体系（20 μL）

组分	用量
2× Master Mix	10 μL
上游引物（10 μM）	0.4 μL
下游引物（10 μM）	0.4 μL
探针（10 μM）	0.4 μL
模板 DNA 或 cDNA	1–2 μL
无核酸酶水	补足至 20 μL

2.1 引物和探针浓度

引物浓度：常见的引物浓度为 0.1–1 μM，具体浓度根据实验的需要优化。
探针浓度：通常为 0.1–0.2 μM，根据实验情况调整。

2.2 模板量

DNA 或 cDNA 模板量：通常为 1–2 μL，模板浓度过高或过低均可能影响结果。

3. 程序设置

3.1 预变性

温度设置为 95℃，持续 3 分钟。此步骤有助于完全去除模板中的任何二级结构，并激活 DNA 聚合酶。

3.2 扩增循环

每个循环包括：

变性：95℃，10 秒
退火：60℃，30 秒（在此温度下进行荧光信号采集）
延伸：72℃，30 秒

3.3 熔解曲线（如需要）

温度范围设定为 65–95℃，每步 0.5℃，实时采集荧光信号，帮助验证扩增产物的特异性。

4. 实验运行与监控

4.1 启动实验

在软件中点击“启动”按钮，FQD-16A 将开始自动运行扩增程序。
在实验过程中，FQD-16A 实时监测每个循环中的荧光信号，并绘制扩增曲线。

4.2 监控数据

实验结束后，软件会自动绘制出扩增曲线和熔解曲线，用户可以直观地查看荧光信号变化，评估实验进展和结果。

四、数据分析方法

1. 扩增曲线分析

在实时荧光定量 PCR 中，扩增曲线反映了样本中目标核酸的数量。每个样品的扩增曲线应呈现典型的“S 型”曲线。如果扩增曲线未达到平台期或出现拖尾现象，可能是反应条件不合适，或引物与模板的配对不理想。

1.1 Ct 值的计算

Ct 值（Cycle threshold，循环阈值）表示荧光信号首次达到设定阈值所对应的循环次数。Ct 值与模板的初始浓度成反比，Ct 值越低，初始模板浓度越高。

1.2 标准曲线法

对于绝对定量 PCR，可通过绘制标准曲线，计算出样品中目标基因的拷贝数。标准曲线的制作需要使用已知浓度的标准品进行验证。

2. 熔解曲线分析

熔解曲线分析用于检测扩增产物的特异性，理想的结果是产生单一的尖锐熔解峰。多峰或宽峰可能表明非特异性扩增或引物二聚体。

2.1 Tm 值

Tm 值（熔解温度）是 DNA 双链解链的温度。Tm 值可以反映扩增产物的特异性，不同的扩增产物具有不同的 Tm 值。

2.2 熔解曲线质量控制

检查熔解曲线是否为单一峰，若出现多个峰或宽峰，可能需要优化 PCR 条件或引物设计。

五、常见问题与解决方法

1. 无扩增信号

原因：模板未加入、试剂失效、反应体系配置不当。
解决方法：检查模板和试剂的加入，重新配置反应体系，确保反应条件适当。

2. Ct 值异常

原因：模板浓度过低或过高。
解决方法：调整模板量，使其适应实验要求。过多的模板可能导致非特异性扩增。

3. 非特异性扩增

原因：引物设计不合理、退火温度设置不当。
解决方法：优化引物设计，增加退火温度，减少引物二聚体。

4. 熔解曲线多峰

原因：非特异性扩增产物或引物二聚体。
解决方法：重新设计引物，调整 PCR 条件，优化退火温度。

六、总结

博日 FQD-16A 实时荧光定量 PCR 仪凭借其高灵敏度、高精度和灵活的操作性，广泛应用于多种分子生物学研究领域。通过正确的实验设置、数据分析及优化反应条件，用户可以利用该仪器高效、准确地进行基因定量、突变检测和其他分子检测任务。

实时荧光定量 PCR 的精确性依赖于反应体系的配置、仪器设置及数据分析方法。理解并掌握这些操作流程，可以确保实验结果的可靠性，从而为科研人员和临床医生提供准确的检测数据。