一、引言

博日 FQD-16A 实时荧光定量 PCR 仪广泛应用于基因表达分析、基因突变检测、病原体检测以及其他分子生物学研究领域。试剂的质量和配置直接影响 PCR 实验的准确性与灵敏度，进而影响最终的实验结果。因此，试剂的准备是确保 FQD-16A 实验顺利进行的关键环节。

本指南将详细介绍 FQD-16A 实验中常用的试剂准备，包括 2× PCR Master Mix、引物、探针、模板及其他添加剂 的准备方法、注意事项、常见问题的排查和优化策略，以确保试剂准备的准确性与实验结果的可靠性。

二、试剂准备的基本要求

1. 试剂的纯度要求

试剂的纯度对 PCR 实验至关重要，杂质可能导致扩增失败、非特异性扩增或污染。尤其是模板 DNA、RNA 和引物等关键试剂，其纯度需要达到一定标准。一般来说：

• DNA 模板：要求无蛋白质、RNA、酚或盐等污染物。

• RNA 模板：需要确保其完整性，避免降解。RNA 模板常使用 DNase 处理，以消除 DNA 污染。

• 引物和探针：需高纯度，避免杂质影响反应特异性。

2. 试剂的新鲜度

大部分 PCR 试剂，如 DNA 聚合酶、dNTPs 和引物，长期储存可能发生降解。因此，建议每次实验前检查试剂的有效期，并确保试剂不反复冻融。尽量使用新鲜准备的试剂以保证其稳定性。

3. 无核酸酶水

准备反应体系时，应使用无核酸酶水。水源必须经过严格的去核酸酶处理，以避免外源 DNA 或 RNA 的污染。使用未经处理的水可能导致反应体系中的模板污染，影响实验结果。

三、常用试剂准备及配置方法

1. 2× PCR Master Mix 配制

2× Master Mix 是 PCR 实验中常用的试剂混合液，通常含有 DNA 聚合酶、dNTPs、Mg²⁺、缓冲液等成分。使用 2× Master Mix 可以简化配置过程，减少实验误差。

基本配置（20 μL 体系）：

注意事项：

• 2× Master Mix 中的 Mg²⁺ 浓度通常是固定的，使用时不需要单独加入，但可根据需要调整。

• 在配置 Master Mix 时，应使用高质量的试剂，避免任何杂质的影响。

常见问题与优化：

• 反应体系不稳定：可能是由于 Master Mix 配方不完整或试剂变质，建议更换新的试剂并检查存储条件。

• 扩增效率差：可能是 Mg²⁺ 浓度不合适，需通过优化实验条件进行调整。

2. 引物和探针的准备

引物和探针是 PCR 中至关重要的成分，良好的引物设计能够确保扩增的特异性和效率。引物应在化学合成后进行纯化并溶解到适当浓度。

引物配置（10 μM）：

• 溶解方法：将引物溶解在无核酸酶水中，配制为 10 μM 的浓度，常见的引物浓度为 0.2–1 μM。

• 存储：引物溶液通常需要存放在 -20℃ 低温环境下，避免反复冻融。

探针配置（10 μM）：

• 荧光探针的选择：根据实验需求，选择适合的荧光探针（如 TaqMan 探针）。探针的设计要确保与目标序列的特异性配对。

• 探针存储：探针通常需要溶解在无核酸酶水中，并存储在 -20℃。

常见问题与优化：

• 引物二聚体形成：若引物设计不合适，可能形成引物二聚体或发卡结构。可以通过在线工具优化引物设计，避免这些不利于扩增的结构。

• 引物浓度过低或过高：引物浓度过低会导致扩增效率低，而过高可能导致非特异性扩增。需要通过实验验证最佳引物浓度。

3. DNA 模板的准备

PCR 实验中的 DNA 模板需要具有高纯度和足够的浓度。模板的质量直接影响到扩增的效率和特异性。

模板准备：

• 基因组 DNA：从细胞或组织中提取基因组 DNA，确保提取方法无污染。

• cDNA：对于 RNA 样品，需先通过反转录合成 cDNA。反转录过程中，需使用高质量的反转录酶和 RNA 模板。

常见问题与优化：

• 模板浓度不合适：模板量过少会导致扩增信号弱，过多则可能引发非特异性扩增。模板浓度应根据实验要求进行优化，通常为 1–2 μL。

• 模板污染：确保模板不含有 RNA 或蛋白质等污染物，这些污染物可能抑制 PCR 反应。

四、反应体系的常见问题及解决方案

1. 扩增失败或无信号

• 原因：反应体系配置不当，或模板质量差。

• 解决方法：

• 检查试剂是否新鲜，确保引物和探针的浓度合适。

• 增加模板量，确保模板浓度适宜。

• 优化 PCR 反应条件，如调整退火温度或延伸时间。

2. 引物二聚体或非特异性扩增

• 原因：引物设计不合理，或退火温度过低。

• 解决方法：

• 重新设计引物，避免形成二聚体或发卡结构。

• 提高退火温度，提高引物的特异性。

• 检查引物的 GC 含量，理想情况下为 40–60%。

3. 荧光信号过低

• 原因：荧光染料浓度不足或模板量不足。

• 解决方法：

• 增加荧光染料浓度，确保灵敏度。

• 调整模板量，确保足够的 DNA 被扩增。

• 确认荧光通道设置正确。

五、反应体系的优化技巧

1. 优化引物浓度

• 根据实验需求，可以通过调节引物浓度来优化 PCR 条件。一般来说，引物浓度在 0.1 μM 到 1 μM 之间，最佳浓度需要通过实验验证。

2. Mg²⁺ 离子浓度的优化

• Mg²⁺ 浓度对 PCR 的扩增效率影响显著。过低的 Mg²⁺ 会导致扩增失败，而过高的 Mg²⁺ 会导致非特异性扩增。一般情况下，推荐使用 1.5–3.0 mM 的 Mg²⁺ 浓度。

3. 优化退火温度

• 退火温度直接影响引物的特异性与扩增效率。通常，退火温度应该比引物的 Tm 值低 3–5℃，过低的退火温度会导致非特异性扩增，过高则可能导致扩增效率低。

4. 使用添加剂

• 在某些难扩增的模板中，添加如 DMSO 或 BSA 等添加剂能够提高扩增效率，减少模板中的抑制因子。

六、总结

博日 FQD-16A 实时荧光定量 PCR 仪的试剂准备是成功完成实验的关键环节，合理配置 PCR 反应体系和优化试剂的浓度可以显著提高实验的灵敏度和特异性。通过详细了解试剂的组成、配置方法以及常见问题的处理，用户能够有效提升实验质量，确保高效、准确的实验结果。