一、引言

博日 FQD-16A 实时荧光定量 PCR 仪是一款高效、精确的小型 PCR 仪器，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、突变分析及定量 PCR 实验中。其高灵敏度的光学系统和精确的温控技术，使其成为实验室中不可或缺的重要工具。

为了确保实验的顺利进行，规范的操作规程至关重要。本规程详细介绍了从仪器开机到实验完成的各个步骤，并提供了常见问题的处理方法，以保证 FQD-16A 实验的高效性、稳定性和可靠性。

二、仪器开机与初始化

1. 仪器开机

• 接通电源并打开仪器主机的电源开关。

• 打开电脑端的软件界面，确保设备与计算机连接正常。

• 设备开机后，屏幕显示仪器状态，进行自检，确保无故障提示。

2. 确认电源和温控

• 确认电压稳定在 100–240V 之间，避免电源波动影响设备运行。

• 在启动前，检查仪器的加热模块是否工作正常，温控是否精准。

三、实验前准备

1. 实验环境

• 确保实验室温度保持在 18–30℃，湿度控制在 30–70% 之间。

• 避免强光直射和强电磁干扰。保持实验台面整洁，避免杂物影响操作。

2. 样品和试剂

• 选择合适的模板（如 DNA 或 cDNA）。若使用 RNA 样品，需提前进行反转录。

• 使用高质量的引物，推荐长度为 18–24 bp，GC 含量 40–60%。

• 选择兼容的 PCR 试剂盒，例如 SYBR Green 或 TaqMan 探针法试剂。

3. 耗材准备

• 使用适配 FQD-16A 的 0.2 mL PCR 管或八联管。

• 配备无 RNA/DNA 酶污染的移液器和枪头。

4. 环境检查

• 确保实验室内有足够的空气流通，避免温度和湿度的急剧波动。

• 检查反应模块、热盖和光学系统是否干净，避免灰尘或杂质影响实验结果。

四、试剂体系配置

1. 标准体系配置（以 20 μL 体系为例）

• 2× Master Mix：10 μL

• 上游引物（10 μM）：0.4 μL

• 下游引物（10 μM）：0.4 μL

• 模板 DNA/cDNA：1–2 μL

• 高纯度水：补足至 20 μL

2. 体系配置注意事项

• 试剂配置时应避免气泡产生。

• 配制完成后，轻轻混匀并瞬时离心，确保反应均匀。

• 配置过程中使用高质量无 RNA/DNA 酶水。

3. 阴性与阳性对照设置

• 每次实验必须设置阴性对照（NTC），确保试剂和设备的洁净。

• 根据需要设置阳性对照，以确保试剂的有效性和实验的可靠性。

五、仪器操作步骤

1. 上样操作

• 打开加热模块盖板，确保反应管或八联管能够正确放入孔位。

• 将配置好的 PCR 反应体系小心加入反应管中，确保管壁干净。

• 关闭加热模块盖板，确保反应管与模块的紧密接触。

2. 程序设置

• 在 FQD-16A 软件中设置实验程序。常见的设置包括：

• 预变性：95℃，3 min

• 扩增循环：95℃，10 秒；60℃，30 秒（荧光采集），共 40 次

• 熔解曲线（如需要）：65–95℃，每步 0.5℃，实时采集信号

• 确保选择正确的荧光通道，通常 SYBR Green 选择 FAM 通道，TaqMan 探针根据探针标记选择通道。

3. 实验运行

• 点击“启动”按钮，仪器会自动进入扩增阶段并进行实时荧光信号采集。

• 程序完成后，仪器会自动进入熔解曲线分析阶段，实时显示荧光信号随温度变化的情况。

六、数据分析与解读

1. 扩增曲线

• 阳性样品：应呈现典型的“S 型”扩增曲线，荧光信号随着循环次数的增加而上升，最终达到平台期。

• 阴性对照：无荧光信号，确保实验环境没有污染。

2. 熔解曲线

• 单一尖锐峰：表示扩增产物为特异性产物。

• 多峰或宽峰：表示可能存在引物二聚体或非特异性产物。

3. Ct 值计算

• 绝对定量：通过标准曲线计算样品中核酸的拷贝数。

• 相对定量：采用 ΔCt 或 ΔΔCt 方法进行基因表达分析。

4. 数据导出

• 实验结束后，可选择导出实验结果。支持 Excel、PDF 等多种格式，便于进一步分析与报告生成。

七、常见问题及解决方法

1. 无扩增信号

• 原因：模板未加入或模板质量差，试剂失效。

• 解决方法：检查模板是否正确加入，重新配置试剂体系。

2. Ct 值异常

• 原因：模板浓度过低或过高，反应体系配制不当。

• 解决方法：调整模板量，优化引物浓度。

3. 熔解曲线出现多峰

• 原因：引物二聚体或非特异性扩增。

• 解决方法：优化引物设计，检查 PCR 条件，避免引物二聚体。

4. 荧光信号过低

• 原因：检测通道选择错误，染料或探针浓度不足。

• 解决方法：确认通道选择正确，使用新鲜试剂。

八、仪器维护与保养

1. 日常维护

• 每次实验后用无尘布擦拭仪器外壳，保持清洁。

• 清洁光学窗口时避免刮伤，建议使用专用镜头布。

• 检查反应模块表面是否有残留试剂，清洁时避免液体渗入模块。

2. 定期保养

• 每月：检查 USB 接口和电源线是否损坏，清洁散热风扇。

• 每年：进行设备的全面校准与维护，确保温控和光学系统的准确性。

3. 故障排查

• 若出现设备异常或程序无法启动，尝试重新启动软件并检查连接。

• 设备长时间无响应时，重启仪器，若问题依旧存在，请联系技术支持。

九、实验安全与注意事项

1. 操作规范

• 实验过程中佩戴实验服、手套和防护眼镜，避免与试剂直接接触。

• 样品与反应液应在规定区域进行操作，避免交叉污染。

2. 废弃物处理

• 使用过的 PCR 管应高压灭菌后处理。

• 废液应严格按实验室规定进行处理，避免污染环境。

3. 设备安全

• 避免仪器过热，定期检查散热系统，保持通风良好。

• 避免强烈电磁干扰，确保电源接地良好。

十、总结

博日 FQD-16A 实时荧光定量 PCR 仪具有高灵敏度、高精度和操作简便等优点，是科研、医学、食品安全、农业和环境监测领域的重要工具。通过遵循本操作规程，实验人员能够有效配置试剂、操作设备、分析数据，从而确保实验结果的准确性与可靠性。

定期维护和科学管理将有效延长仪器的使用寿命，提升实验室工作效率，为科研及应用实验提供强有力的支持。