博日实时荧光定量pcr仪FQD-16A操作流程
时间：2025-08-27

一、实验原理

实时荧光定量 PCR（qPCR）是在传统 PCR 技术基础上发展而来的一种分子检测方法。其核心是通过荧光信号的积累，实时监测核酸扩增过程，并在反应结束后对数据进行定性或定量分析。荧光信号与扩增产物的数量成正比，软件会自动绘制扩增曲线，计算循环阈值（Ct 值），实现核酸定量检测。

博日 FQD-16A 仪器采用高精度温控系统与灵敏光学检测平台，结合直观的软件界面，能够满足基础科研、临床检测、食品安全和环境监测等多领域的实验需求。

二、实验前准备

1. 实验环境

  • 温度范围：18–30℃。

  • 湿度范围：30–70%。

  • 避免强光直射和强电磁干扰。

  • 实验台面应稳固、水平，周边保持整洁。

2. 仪器检查

  • 确认电源接通且电压稳定。

  • 检查 USB 通信是否正常。

  • 查看反应模块与热盖是否清洁无异物。

3. 样品与试剂

  • 核酸提取：DNA 或 RNA，RNA 需反转录为 cDNA。

  • 引物：长度一般 18–24 bp，GC 含量 40–60%。

  • Master Mix：含荧光染料或探针体系。

  • 无 RNA/DNA 酶水：作为稀释与补充溶液。

  • 耗材：0.2 mL PCR 管或八联管。

4. 分区操作

  • 前处理区：样品提取。

  • 配置区：反应体系配制。

  • 扩增区：PCR 仪操作。

  • 分析区：结果查看与数据导出。

三、试剂体系配置

以 20 μL 体系为例（SYBR Green 法）：

  • 2× Master Mix：10 μL

  • 上游引物（10 μM）：0.4 μL

  • 下游引物（10 μM）：0.4 μL

  • 模板：1–2 μL

  • ddH2O：补足至 20 μL

注意事项：

  • 配置时需在冰上操作。

  • 加样后轻轻混匀并瞬时离心。

  • 每批实验必须设置阴性对照（NTC），必要时加阳性对照。

四、仪器操作步骤

  1. 开机

    • 接通电源，打开主机。

    • 启动电脑软件，确认通信正常。

  2. 上样

    • 将配置好的 PCR 管放入反应模块。

    • 确认管壁干净、无气泡。

    • 关闭热盖，确保与管盖贴合。

  3. 温控程序设置

    • 预变性：95℃，3 分钟。

    • 循环：95℃，10 秒；60℃，30 秒，采集荧光，共 40 次。

    • 熔解曲线：65–95℃，每步升温 0.5℃，实时采集信号。

  4. 通道选择

    • SYBR Green：选择 FAM 通道。

    • 探针法：根据标记基团选择 FAM、HEX、ROX 或 Cy5。

五、软件设置

  1. 实验新建

    • 输入实验名称、样品编号、通道名称。

    • 选择检测模式：定性、绝对定量或相对定量。

  2. 荧光通道配置

    • 按需选择 1–4 个通道。

    • 避免光谱重叠的探针组合。

  3. 程序编辑

    • 设置循环条件与熔解曲线。

    • 保存方法以便下次直接调用。

  4. 数据监控

    • 实验运行时实时显示扩增曲线。

    • 可随时查看 Ct 值变化。

六、实验运行

  1. 启动实验

    • 确认参数与样品布局。

    • 点击“运行”，仪器自动完成扩增和检测。

  2. 运行过程

    • 全程无需操作，软件实时显示曲线。

    • 禁止中途频繁开关热盖。

  3. 实验结束

    • 系统提示实验完成，保存数据。

    • 打开热盖，取出 PCR 管。

七、数据分析

  1. 扩增曲线

    • 阳性样本应出现典型“S 型”曲线。

    • 阴性对照应无信号。

    • Ct 值越低，表示模板浓度越高。

  2. 熔解曲线

    • 单一峰表示特异性良好。

    • 多峰提示存在非特异扩增或引物二聚体。

  3. 定量方法

    • 绝对定量：通过标准曲线计算样品拷贝数。

    • 相对定量：采用 ΔCt 或 ΔΔCt 方法进行基因表达比较。

  4. 结果导出

    • 数据可导出为 Excel、PDF 或图片。

    • 保存原始文件便于后续分析。

八、常见问题与排查

  1. 无扩增曲线

    • 检查模板是否加入。

    • 确认酶、引物是否失效。

    • 程序参数是否正确。

  2. Ct 值偏大

    • 模板浓度不足。

    • 存在反应抑制剂。

  3. 熔解曲线多峰

    • 引物设计不合理。

    • 体系受到污染。

  4. 荧光信号过低

    • 通道选择错误。

    • 染料或探针浓度不足。

九、维护与安全

  1. 维护

    • 每次实验后清洁模块和外壳。

    • 光学窗口避免接触或刮伤。

    • 定期校准，保持温控与光学精度。

  2. 安全

    • 实验过程中佩戴手套、实验服。

    • 严格区分实验区域，避免交叉污染。

    • 废弃管需经高压灭菌后处理。

十、综合总结

博日 FQD-16A 实时荧光定量 PCR 仪操作流程主要包括：

  1. 实验前准备，确保环境、样品和试剂合格；

  2. 反应体系配置，合理设置对照；

  3. 上机操作与程序设置，规范执行各环节；

  4. 软件控制与数据采集，实时监控实验进展；

  5. 扩增结果分析，结合扩增曲线和熔解曲线综合判断；

  6. 维护与安全管理，保证设备稳定运行与实验可靠性。

通过严格遵循本操作流程，实验人员能够获得准确、可靠的检测结果，同时延长仪器使用寿命，确保实验室的高效与规范。

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