博日实时荧光定量pcr仪FQD-16A实验指南

时间：2025-08-27

一、实验原理

实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）是一种基于 PCR 技术的发展型分子检测方法。其核心是利用荧光染料或荧光探针，在扩增反应过程中实时监测荧光信号变化。荧光强度与扩增产物数量成正比，通过软件处理得到循环阈值（Ct 值），实现核酸的定性与定量分析。

博日 FQD-16A 仪器采用精确的温控系统与灵敏的光学检测系统，适配多种荧光通道，能够兼顾 SYBR Green 法和探针法，满足多样化实验需求。

二、实验前准备

1. 实验环境

环境温度保持在 18–30℃，湿度 30–70%。
避免强光直射与强电磁干扰。
保持台面清洁，避免粉尘和气流。

2. 试剂与耗材

荧光定量 PCR 试剂盒（SYBR Green 或 TaqMan 探针体系）。
模板 DNA 或 RNA（RNA 需反转录为 cDNA）。
上下游引物。
高纯度去离子水或无核酸酶水。
0.2 mL PCR 管或八联管。
无 RNA/DNA 酶污染的枪头与移液器。

3. 样品处理

提取 DNA 或 RNA 时应遵循分区操作原则。
RNA 样品需避免降解，可置于 -80℃ 保存。
检测前确保模板浓度适宜，过高或过低均可能影响结果。

三、试剂体系配置

以 20 μL 体系为例：

2× Master Mix：10 μL
上游引物（10 μM）：0.4 μL
下游引物（10 μM）：0.4 μL
模板 DNA/cDNA：1–2 μL
ddH2O：补足至 20 μL

注意事项：

体系配制应在冰上操作，减少非特异扩增。
配制完成后应轻轻混匀并瞬时离心，避免气泡干扰。
设置阴性对照（NTC），必要时添加阳性对照。

四、FQD-16A 仪器操作流程

1. 仪器开机

接通电源，启动主机。
打开电脑端软件，确认仪器与计算机连接正常。

2. 样品上机

打开加热模块盖板。
将 PCR 管或八联管按顺序放入反应模块，确保管壁与模块充分接触。
检查管口密封性，防止蒸发。
关闭盖板。

3. 程序设置

在软件中新建实验：

设置预变性：95℃，3 分钟。
设置循环参数：

95℃，10 秒；
60℃，30 秒（采集荧光）；
共 40 个循环。

若需熔解曲线：设置 65–95℃ 梯度升温，每步 0.5℃，实时采集荧光。

4. 荧光通道选择

SYBR Green 常用 FAM 通道。
TaqMan 探针可根据荧光基团选择 FAM、HEX、ROX 或 Cy5 通道。
多重检测时应在软件中逐一设定。

5. 启动运行

确认实验参数正确。
点击“运行”，仪器开始扩增与荧光检测。

五、结果分析

1. 扩增曲线

正常阳性样品应出现典型“S 型”曲线。
阴性对照不应有荧光信号。
Ct 值反映模板起始量，高浓度模板 Ct 值较低。

2. 熔解曲线

单一尖锐峰说明扩增产物特异性良好。
多峰或宽峰提示非特异扩增或引物二聚体。

3. 定量结果

绝对定量：通过标准曲线计算样品拷贝数。
相对定量：利用 ΔCt 或 ΔΔCt 方法进行基因表达分析。

4. 数据导出

软件支持导出 Excel、PDF 或图片格式。
建议实验后立即备份，便于归档和复查。

六、常见问题与解决办法

无扩增曲线

检查模板和试剂是否加入。
确认循环参数设置正确。

Ct 值偏大

模板浓度低。
存在反应抑制剂。

熔解曲线异常

引物设计不合理。
样品或体系受到污染。

荧光信号过低

样品降解或模板量不足。
检测通道选择不正确。

七、日常维护

使用后处理

关闭电源，保持仪器干燥。
定期清洁模块表面。

光学系统保养

检测窗口避免触碰。
避免使用强腐蚀性清洁剂。

定期校准

每 6–12 个月进行一次专业校准。
长期不使用需妥善存放。

八、安全注意事项

实验过程中佩戴实验服和手套。
样品与产物应在不同区域操作，避免污染。
使用过的 PCR 管需高压灭菌或按照实验室规定处理。
实验数据应及时保存和备份，防止丢失。

九、综合建议

在实验前充分了解实验目的，合理设计引物与对照。
严格按照实验流程执行，避免跨区操作带来污染。
定期总结实验经验，优化扩增条件，提高数据可靠性。
配合标准化操作规程，形成完整的实验档案。

十、总结

博日 FQD-16A 实时荧光定量 PCR 仪作为一款小型化、高性能设备，能够满足从基础科研到临床检测、从食品安全到动植物检疫的多领域需求。通过本指南所述流程，实验人员可以规范地完成样品准备、体系配置、仪器操作、数据分析与日常维护，最大限度发挥设备的性能。

规范化、标准化的操作不仅能提高实验准确性和重复性，还能降低错误率和污染风险，使实验结果更具可信度。