实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）是一种在核酸扩增过程中实时监测反应体系内荧光信号变化的技术。荧光信号强度与目标核酸扩增量成比例，通过软件绘制扩增曲线并计算循环阈值（Ct 值），可实现定性与定量分析。
博日 FQD-16A 实时荧光定量 PCR 仪是一款小型化、多功能检测平台，具备以下特点：
16 孔设计，适合小批量实验和教学科研场景。
多通道荧光检测系统，可兼容 SYBR Green 法和探针法。
升降温速度快，温控均一性好，确保结果稳定。
配套软件支持多种分析模式，包括标准曲线法、相对定量法和熔解曲线分析。
掌握该仪器的标准实验流程，有助于保证结果的可靠性与实验的重复性。
保持实验室空气洁净，无强烈气流、粉尘和腐蚀性气体。
温度保持在 18–30℃，湿度建议 30–70%。
仪器应放置于平稳台面，避免震动与阳光直射。
qPCR 反应试剂盒（含 Master Mix、荧光染料或探针）。
上下游引物（需根据目标基因设计）。
模板 DNA 或 RNA（RNA 需经反转录制备 cDNA）。
无核酸酶的超纯水。
适配 FQD-16A 的 PCR 管或八联管。
无 RNase/DNase 的枪头、移液器。
提取 DNA 或 RNA 时需严格避免降解。
检测 RNA 时，必须进行反转录步骤生成稳定的 cDNA。
样品浓度应在适合范围，过高或过低均会影响扩增曲线。
以 20 μL 反应体系为例（常见 SYBR Green 体系）：
2× Master Mix：10 μL
上游引物（10 μM）：0.4 μL
下游引物（10 μM）：0.4 μL
模板：1–2 μL
ddH2O：补足至 20 μL
注意事项：
体系配制应在冰上进行，降低酶活性丧失与非特异扩增风险。
配制过程中避免产生气泡，可在离心机中瞬时离心。
每次实验需同时设置阴性对照（NTC）和阳性对照。
打开主机电源，确认设备进入待机状态。
在电脑上启动配套软件，确保仪器与计算机连接正常。
打开仪器反应模块盖板。
将配置好的 PCR 管按孔位顺序插入反应模块。
检查管口密封性，避免蒸发影响扩增结果。
关闭盖板，确保紧密贴合。
在软件界面新建实验任务：
输入实验名称与保存路径。
设置循环程序，例如：
95℃，10 s
60℃，30 s（采集荧光），共 40 次
预变性：95℃，3 min
循环：
若采用熔解曲线分析，则需在最后增加：
65–95℃ 梯度升温，每步 0.5℃，实时采集荧光。
SYBR Green 法选择 FAM 通道。
探针法根据探针染料选择 FAM、HEX、ROX 或 Cy5 通道。
多重检测时需在软件中逐一勾选通道并命名。
检查参数是否正确。
点击“运行”，仪器开始升降温和荧光检测。
实验全程无需人工干预，待反应完成后自动生成数据文件。
阳性样本应呈典型的“S 型”曲线。
阈值线与曲线交点为 Ct 值。
阴性对照应无信号，若有曲线提示污染或非特异扩增。
单一尖锐峰代表扩增产物特异性强。
多峰或宽峰可能意味着引物二聚体或非特异扩增。
绝对定量：根据标准曲线 Ct 值与模板拷贝数关系计算样品浓度。
相对定量：使用 ΔCt 或 ΔΔCt 方法，通常以内参基因作为标准。
可将结果导出为 Excel、PDF、图片等多种格式。
推荐实验完成后立即备份，以便后续分析和发表。
无扩增曲线
检查模板和试剂是否加错或降解。
确认循环条件设置正确。
Ct 值偏大或不稳定
模板浓度过低或引物效率不足。
可优化引物或提高模板浓度。
熔解曲线出现多峰
引物设计不合理。
检查操作是否导致污染。
荧光信号弱或平台期不明显
样品存在抑制剂。
尝试稀释模板或更换提取方法。
维护
每次实验结束后，关闭电源并保持仪器干燥。
用无尘布轻轻擦拭反应模块，避免化学物质残留。
光学检测部分不得触碰或划伤。
操作规范
严格区分试剂准备区与产物分析区，减少污染风险。
上样与加样过程中应佩戴一次性手套。
使用过的管子应高压灭菌或按规定废弃。
定期备份实验数据。
建议建立实验日志，记录样品来源、体系配制细节及仪器运行情况。
博日 FQD-16A 实时荧光定量 PCR 仪具有体积小巧、操作简便、检测灵敏度高等优点，非常适合科研教学及应用实验室开展分子检测工作。实验流程主要包括：
样品与试剂准备；
反应体系配置；
上机操作与程序设置；
荧光采集与扩增；
数据分析与结果导出。
掌握上述规范流程，不仅能够提高实验的准确性和重复性，还能帮助实验人员快速定位问题、保证检测结果的可靠性。
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