宏石荧光定量PCR仪 SLAN-48P 实验教程

一、实验目的与意义

荧光定量 PCR（qPCR）是一种在 DNA 扩增过程中实时检测荧光信号的技术，能够在分子水平上对基因表达量、病原体载量、基因突变情况进行定性或定量分析。宏石 SLAN-48P 作为中通量实时荧光定量 PCR 仪器，支持 48 孔检测位点，适合中小型实验室常规检测和教学科研应用。

通过本实验教程，实验人员可系统掌握 SLAN-48P 的使用方法，包括：

1. 熟悉荧光定量 PCR 的基本原理；

2. 掌握反应体系的配置与对照设置；

3. 学会正确操作 SLAN-48P 进行扩增检测；

4. 能够独立完成结果分析与实验报告。

二、实验原理简述

荧光定量 PCR 的核心是将荧光染料或探针引入 PCR 反应体系。随着 DNA 片段的指数级扩增，荧光信号与扩增产物量呈正相关。SLAN-48P 的光学模块可在每个循环的特定阶段采集荧光信号，通过软件分析生成扩增曲线、Ct 值和标准曲线，从而实现绝对或相对定量。

• SYBR Green 法：利用荧光染料与双链 DNA 结合后发光，适合通用检测。

• TaqMan 探针法：利用特异性探针水解释放荧光信号，特异性更强，适合定量检测。

• 熔解曲线分析：通过升温逐步解链，判断扩增产物的特异性。

三、实验材料与准备

1. 仪器设备

• 宏石荧光定量 PCR 仪 SLAN-48P

• 专用电脑与分析软件

• 微量移液器及带滤芯枪头

• 高速离心机

• 超净工作台或洁净工作区

2. 耗材

• 48 孔 PCR 板或八联管

• 光学透明封板膜

• 无核酸酶水

• 一次性手套、口罩、实验服

3. 试剂

• PCR 预混液（含缓冲液、dNTP、酶）

• 特异性引物与探针

• 模板 DNA 或 RNA（RNA 需先逆转录为 cDNA）

• 阴性对照与阳性对照

• 梯度稀释标准品（用于标准曲线）

4. 环境条件

• 室温 18–30℃，相对湿度 40–70%

• 区域划分明确：试剂准备区、样品处理区、扩增区

四、实验步骤

1. 反应体系配置

1. 计算体系用量

• 单个反应体系 20 μL 或 25 μL，根据实验设计确定。

• 总量需包含所有样品与对照，并额外预留 10%。

2. 组分配置（以 20 μL 为例）：

• 预混液：10 μL

• 引物与探针：各 0.5–1 μL

• 模板：2 μL

• 无核酸酶水：补足至 20 μL

3. 注意事项

• 配置时避免气泡，体系需轻轻混匀。

• 每次移液更换枪头。

• 对照必须同时设置：NTC（无模板对照）、阳性对照、标准品。

2. 样品加载与上机

1. 将反应体系分装至 48 孔板或八联管中。

2. 使用透明光学封膜密封，确保无气泡残留。

3. 短暂离心，确保液滴集中在管底。

4. 打开 SLAN-48P 热盖，将反应板放置于样品槽内，确认方向正确并紧密贴合。

3. 软件设置

1. 启动 SLAN-48P 软件，新建实验项目。

2. 输入实验名称、操作者姓名与日期。

3. 设定热循环程序：

• 预变性：95℃ 3 分钟

• 变性：95℃ 15 秒

• 退火/延伸：60℃ 30 秒（采集荧光）

• 循环 40–45 次

4. 选择荧光通道（如 FAM、HEX、ROX、Cy5）。

5. 若需熔解曲线，设置 65–95℃，升温速率 0.2℃/s。

6. 保存并检查参数无误，启动运行。

4. 实验运行

• SLAN-48P 将自动进行热循环与荧光采集。

• 实验过程中可在电脑界面实时查看扩增曲线。

• 实验总时长约 1.5–2 小时。

五、数据分析

1. 扩增曲线

• 检查对照情况：阴性对照无扩增曲线，阳性对照曲线应在合理范围。

• 样品 Ct 值与对照比较，判断是否为阳性。

2. 标准曲线

• 由标准品生成的 Ct 值绘制曲线，R² ≥ 0.99。

• 扩增效率在 90–110% 范围为合格。

3. 熔解曲线

• 单一峰代表扩增产物特异性好。

• 多峰提示可能存在非特异性扩增或引物二聚体。

4. 定量计算

• 绝对定量：利用标准曲线计算样本浓度。

• 相对定量：采用 ΔΔCt 法，以内参基因（如 GAPDH）为参考。

六、实验结果报告

实验报告应包含以下内容：

1. 实验目的与样品信息；

2. 反应体系与参数设置表；

3. 扩增曲线与 Ct 值表格；

4. 标准曲线与效率指标；

5. 熔解曲线图；

6. 结果分析与结论；

7. 异常情况说明与处理。

七、注意事项

1. 防污染

• 严格分区操作，避免气溶胶污染。

• 配置体系使用滤芯枪头，操作轻柔。

2. 温控与光学

• 样品放置时确保 PCR 板与模块紧密贴合。

• 光学窗口保持清洁，避免影响信号采集。

3. 对照设置

• 阴性对照是实验质量监控的关键。

• 标准品浓度必须准确稀释，避免曲线偏差。

八、常见问题与解决

1. 无扩增信号

• 检查模板是否降解。

• 确认是否选择正确的荧光通道。

2. Ct 值过高

• 模板量过低或提取不完全。

• 退火温度过高，需优化。

3. 熔解曲线多峰

• 引物二聚体，应调整引物设计。

• 优化退火温度。

4. 阴性对照扩增

• 存在气溶胶污染，应更换试剂并重新实验。

九、维护与保养

1. 日常维护

• 实验后用无水乙醇清洁热循环模块。

• 光学窗口如有灰尘或指纹，用镜头纸轻拭。

2. 定期保养

• 每 3–6 个月进行温度校准。

• 每年进行光学校准。

• 检查并更新软件至最新版本。

3. 存放要求

• 长期停机需关闭电源并覆盖防尘罩。

• 存放环境保持干燥、通风。

十、总结

SLAN-48P 实验教程系统介绍了荧光定量 PCR 的操作步骤，从试剂准备、体系配置、仪器运行到数据分析和报告整理，构建了完整的实验流程。

通过严格遵循本教程，实验人员不仅能熟练掌握 SLAN-48P 的操作，还能有效避免常见问题，提高数据的可靠性与重复性。无论在临床检测还是基础科研中，SLAN-48P 都是一款高效、稳定的工具，能够为实验提供坚实的技术支撑。