实时荧光定量PCR（qPCR）是现代分子生物学和临床检验中应用最广泛的技术之一。它通过在扩增过程中实时监测荧光信号，判断核酸的存在和数量，从而实现对基因的定性与定量分析。宏石荧光定量PCR仪SLAN-48P是一款中通量核酸检测设备，能够同时检测48个样品，广泛应用于临床病原体检测、肿瘤相关基因研究、食品转基因成分分析以及环境微生物监测。
为了充分发挥SLAN-48P的性能，实验人员必须严格遵循标准化的操作流程。本资料旨在系统性介绍从实验准备到数据分析的全过程，为科研和临床检测提供可靠参考。
SLAN-48P操作流程可以概括为以下七大环节：
实验前准备
样品提取与核酸检测前处理
PCR反应体系配置
加样与反应板封装
仪器设定与扩增运行
数据采集与结果分析
实验结束与维护保养
这七个环节相辅相成，环环相扣，保证实验的完整性和准确性。
实验室应按照分区原则进行布局：核酸提取区、反应体系配置区和扩增检测区应相互独立。
室温保持在18–30℃，相对湿度40–70%。
使用紫外灯照射或75%酒精擦拭工作台，降低气溶胶污染风险。
确认电源和通信接口连接良好。
检查样品仓和光学窗口，确保无灰尘、液滴或残留物。
打开仪器电源，观察自检状态是否正常。
启动配套软件，检查是否为最新版。
新建实验文件夹，填写实验名称、日期、实验人员等信息。
血液、组织、细胞、拭子、食品或环境样本均可作为实验对象。
使用标准试剂盒提取DNA或RNA。
RNA样本需进行反转录，转化为cDNA作为模板。
使用分光光度计检测核酸浓度与纯度。
A260/A280比值在1.8–2.0之间为合格。
浓度过低的样本可进行浓缩处理。
PCR缓冲液
dNTP混合液
Mg²⁺溶液
特异性引物与探针
热稳定DNA聚合酶
模板核酸
每孔反应体积控制在20–25 μL。
建议先配制主混合液，再分装至各反应孔，最后加入模板。
对照设置包括阳性对照、阴性对照和无模板对照。
配置时需在洁净台中操作，避免RNAse或DNAse污染。
试剂应低温保存，避免反复冻融。
使用无酶吸头和多道移液器，提高操作一致性。
避免加样过程中产生气泡。
使用光学透明膜封口，保证密封严实。
使用压膜器确保贴膜平整无褶皱。
封板后轻轻离心，使反应液体集中于孔底。
初始变性：95℃，2–3分钟。
循环步骤：
变性：95℃，10秒
退火/延伸：55–65℃，30秒
共40–45循环
常见通道包括FAM、HEX/VIC、ROX、Cy5。
根据试剂选择正确通道，确保目标基因与内参基因分属不同通道。
将反应板放入样品仓，确保位置正确。
关闭仓盖，点击运行。
实验过程中可实时监控扩增曲线。
标准曲线应呈“S”型，包括基线期、指数期和平台期。
异常曲线需结合对照组判断问题来源。
Ct值是荧光信号达到阈值时的循环数。
Ct值小表示模板量大。
同一样本重复孔之间Ct差异不应大于0.5。
通过系列稀释标准品建立Ct值与对数浓度的关系。
理想斜率约 -3.3，扩增效率接近100%。
R² 大于0.99说明线性良好。
适用于SYBR Green体系，用于验证扩增特异性。
单一峰代表特异扩增，多峰提示可能存在引物二聚体或非特异性产物。
软件可自动生成实验报告，包括Ct值表格、扩增曲线、标准曲线和融解曲线。
数据可导出为Excel、PDF等格式，方便归档。
实验结束后关闭电源。
用无水乙醇擦拭外壳。
清理样品仓，保持干燥。
分类存储实验数据，定期备份至服务器。
实验报告应存档，便于溯源。
定期对温控系统和光学系统进行校准。
使用标准品检测仪器性能。
无扩增曲线
检查模板浓度和引物设计。
确认酶是否失活。
Ct值偏高
模板量不足或降解。
阈值设置不合理。
重复性差
加样不均匀。
板膜封合不严，造成蒸发。
曲线异常
光学窗口受污染。
封板存在气泡。
宏石荧光定量PCR仪SLAN-48P操作流程涵盖了从样品处理到数据分析的完整路径。
在实验前准备阶段，应注重环境与仪器检查。
在反应体系配置与加样阶段，应严格比例与标准操作，避免污染。
在仪器运行阶段，应合理设定温控循环和荧光通道。
在数据分析阶段，应结合扩增曲线、Ct值、标准曲线与融解曲线综合判断。
在实验结束后，应做好仪器清洁、数据备份和定期校准。
通过严格遵循操作流程，SLAN-48P能够在临床诊断和科研应用中提供高质量的检测结果，确保实验的科学性和可重复性。
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