宏石荧光定量PCR仪SLAN-48P实验规程

一、前言

荧光定量PCR（Real-time PCR, qPCR）作为一种高灵敏度、高特异性的核酸检测方法，已被广泛应用于分子生物学研究、临床检测、遗传分析及药物研发。宏石SLAN-48P作为中等通量的实时荧光定量PCR仪，兼具灵活性、可靠性与操作简便等优势，特别适合中小型实验室和教学应用。

为了确保实验结果的准确性与可重复性，建立科学、完整的实验规程十分必要。本规程涵盖从实验准备、样品配置、仪器操作、数据分析到质量控制与安全注意事项的全过程，适用于科研实验和临床教学的日常使用。

二、实验目的

1. 掌握SLAN-48P的标准操作方法；

2. 学会正确设置实验方案并执行检测任务；

3. 熟悉扩增曲线与Ct值的获取与解读；

4. 能够生成和导出标准化实验报告；

5. 建立符合实验室管理要求的规范化流程。

三、实验准备

1. 仪器与设备

• 宏石荧光定量PCR仪SLAN-48P；

• 微量移液器及无RNA/DNA污染吸头；

• 48孔反应板或八联管；

• 台式离心机、冰盒；

• 计算机及配套软件系统。

2. 试剂与耗材

• PCR反应缓冲液与聚合酶；

• dNTP混合液；

• 荧光染料（SYBR Green）或特异性探针（TaqMan）；

• 引物对；

• 模板DNA/cDNA；

• 阴性对照（无模板对照NTC）与阳性对照。

3. 环境与条件

• 实验室区域分区：样品准备区、反应配置区、扩增检测区；

• 保持环境洁净，避免RNA/DNA污染；

• 温度20–25℃，相对湿度40–60%。

四、实验操作规程

（一）反应体系配置

1. 根据实验设计配制反应液：

• 反应缓冲液、dNTP、引物、荧光染料/探针；

• 加入模板或对照；

• 补足体积至设定值（通常20 μL或25 μL）。

2. 使用低吸附管/板分装，避免移液误差。

3. 设置阴性与阳性对照，确保结果可靠。

（二）上机前准备

1. 将反应板或八联管密封，避免蒸发与污染；

2. 使用离心机短暂离心，去除液体气泡；

3. 检查反应板条码或手动录入样本编号；

4. 将反应板放置于样品仓中，关闭仓盖。

（三）仪器操作步骤

1. 打开电源与软件；

2. 新建实验任务，填写实验名称、编号与操作者信息；

3. 在板型界面输入样本信息，对应位置编号；

4. 设置循环参数：

• 初始变性温度与时间；

• 退火温度与延伸时间；

• 循环次数（通常35–45循环）。

5. 选择检测通道（FAM、HEX、ROX等）；

6. 保存方案并启动实验。

（四）实时监控

• 实验运行过程中，软件显示扩增曲线；

• 观察曲线是否呈现S型趋势；

• 检查阴性对照是否无信号，阳性对照是否有效。

五、数据分析规程

1. Ct值获取

• 软件自动计算各样本Ct值；

• 若Ct值异常偏高或无值，需结合曲线重新判定。

2. 扩增曲线分析

• 标准曲线呈S型：基线期—指数期—平台期；

• 曲线异常：提前上升可能为污染，无扩增可能为反应失败。

3. 熔解曲线分析（SYBR Green法）

• 单峰表示特异性扩增；

• 多峰或拖尾提示非特异性产物或引物二聚体。

4. 定量分析

• 绝对定量：基于标准曲线计算拷贝数；

• 相对定量：ΔΔCt方法比较基因表达水平。

5. 报告生成

• 软件自动生成报告，包括实验条件、Ct值表、扩增曲线、熔解曲线；

• 可导出Excel、PDF或Word文件，用于科研或临床提交。

六、质量控制

1. 内部控制

• 阴性对照无扩增；

• 阳性对照Ct值在合理范围。

2. 重复性检测

• 同一样本重复孔Ct值差异应小于0.5；

• 扩增曲线形态一致。

3. 结果确认

• 结合熔解曲线和标准曲线，排除假阳性或假阴性。

4. 记录与追溯

• 实验记录完整，包括日期、编号、操作者；

• 所有文件定期备份，符合实验室信息管理规范。

七、常见问题与解决

1. 无扩增信号

• 检查模板质量或体系配置；

• 确认荧光通道设置正确。

1. Ct值差异大

• 移液误差或反应体系不均匀；

• 样本浓度差异过大。

1. 熔解曲线异常

• 调整退火温度；

• 优化引物设计。

1. 曲线提前上升

• 可能存在污染，应更换耗材并检查环境。

八、安全与注意事项

1. 严格区分样本处理区和扩增区，避免气溶胶污染；

2. 操作过程中佩戴手套、口罩，遵守生物安全规范；

3. 使用一次性耗材，避免重复使用；

4. 实验结束后，清洁样品仓和实验台；

5. 废弃物按照实验室生物安全规定处理。

九、实验室管理与人员培训

1. 培训要求

• 操作人员需经过专门培训，熟悉PCR原理与SLAN-48P操作；

• 定期组织考核，保证操作熟练度。

1. 实验室管理

• 每次实验后记录在案；

• 定期检查设备状态与校准情况；

• 建立数据管理制度，确保可追溯性。

十、总结

宏石荧光定量PCR仪SLAN-48P实验规程的制定与执行，保证了实验的规范性、准确性与安全性。通过标准化的操作步骤、科学的数据分析方法与严格的质量控制，用户能够获得稳定可靠的结果。该规程不仅适用于科研实验，也满足临床检测和教学培训的要求。

在分子检测技术不断发展的背景下，SLAN-48P凭借其合理的通量、易用的软件和稳定的性能，将继续在医学检验与科研探索中发挥重要作用。实验规程的严格执行，将为实验室管理、科研创新与临床诊断提供坚实保障。