宏石荧光定量PCR仪SLAN-48P实验流程

一、实验概述

宏石荧光定量PCR仪SLAN-48P是一款中等通量的实时荧光定量PCR检测平台，可同时处理48个样本。它通过精确的温控系统和灵敏的多通道荧光检测模块，实现核酸扩增过程的实时监测，从而完成对目标核酸的定性和定量分析。
在实际应用中，SLAN-48P常用于病原体检测、基因表达分析、转基因成分检测、肿瘤标志物研究以及环境安全监测。为了保证实验结果的准确性和可重复性，必须严格遵循规范化的实验流程。

二、实验流程框架

SLAN-48P实验流程可划分为以下七个主要环节：

1. 实验前准备

2. 样品提取与核酸纯化

3. 反应体系配置

4. 加样与封板

5. 仪器设定与运行

6. 数据采集与分析

7. 实验结束与维护

这七个环节环环相扣，构成了一个完整的实验闭环。

三、实验前准备

1. 实验环境

• 实验室应按照分区要求建立核酸提取区、体系配置区和扩增检测区。

• 温度控制在18–30℃，湿度40–70%。

• 操作前用紫外灯照射或酒精擦拭台面，防止污染。

2. 仪器检查

• 确认电源正常，仪器处于待机状态。

• 检查样品仓和光学窗口，保持清洁干燥。

• 确认计算机与仪器连接良好。

3. 软件准备

• 启动SLAN-48P配套软件，检查是否更新至最新版本。

• 建立实验文件夹并填写实验名称、日期、操作者等基本信息。

四、样品提取与核酸纯化

1. 样品类型

• 可来自血液、组织、细胞、拭子、食品或环境样本。

2. 核酸提取

• 使用专用试剂盒提取DNA或RNA。

• 确保核酸浓度与纯度达标，常用检测方法为分光光度计或荧光定量法。

3. 质量控制

• A260/A280比值在1.8–2.0之间为合格。

• 低质量样本可能导致扩增失败或Ct值偏高。

五、反应体系配置

1. 体系组成

• PCR缓冲液

• dNTP混合液

• Mg²⁺溶液

• 特异性引物与探针

• 热稳定DNA聚合酶

• 模板核酸

2. 体积设计

• 每孔总反应体系体积一般为20–25 μL。

• 建议先制备主混合液，再逐孔加入模板。

3. 对照设置

• 阳性对照：验证体系是否正常。

• 阴性对照：监测可能的污染。

• 无模板对照：确保无假阳性结果。

• 内参对照：用于归一化分析，保证定量结果准确。

六、加样与封板

1. 加样要求

• 操作需在无RNAse、DNAse污染的环境下进行。

• 使用多道移液器可提高一致性。

• 加样时避免产生气泡。

2. 封板步骤

• 使用光学透明膜封口，保证密封严实。

• 使用离心机轻轻离心，使液体沉至孔底。

七、仪器设定与运行

1. 程序设定

• 初始变性：95℃，2–3分钟。

• 循环步骤：

• 变性：95℃，10秒

• 退火/延伸：55–65℃，30秒

• 共循环40–45次

2. 荧光通道设置

• 常见通道：FAM、HEX/VIC、ROX、Cy5。

• 根据试剂选择正确通道并分配至孔位。

3. 启动实验

• 将反应板放入样品仓，确认位置正确。

• 关闭仓盖，点击运行。

• 实验过程中可实时查看扩增曲线。

八、数据采集与分析

1. 扩增曲线

• 理想曲线应呈“S”型，包括基线期、指数期和平台期。

• 若曲线平直或异常，应检查样品或试剂。

2. Ct值判定

• 系统根据阈值自动计算Ct值。

• Ct值越小，代表模板浓度越高。

3. 标准曲线

• 使用已知浓度系列标准品建立曲线。

• 斜率应接近 -3.3，扩增效率约100%。

• R² 大于0.99说明线性良好。

4. 融解曲线

• 适用于SYBR Green体系。

• 单一峰值说明特异性好；多峰提示可能存在非特异性产物。

5. 报告生成

• 软件自动输出实验结果，包括Ct值表格、扩增曲线、标准曲线与融解曲线。

• 数据可导出为PDF、Excel或图片格式。

九、实验结束与维护

1. 仪器清洁

• 实验完成后关闭电源。

• 清洁样品仓，保持干燥无残留。

• 定期清洁光学模块，避免信号干扰。

2. 数据管理

• 分类保存实验数据，建立数据库。

• 定期备份至服务器或移动硬盘，避免丢失。

3. 定期校准

• 对温控与光学系统进行定期校准。

• 使用标准品进行性能检测，确保灵敏度和准确性。

十、常见问题与解决方案

1. 无扩增信号

• 检查是否加入模板或模板质量是否合格。

• 确认引物与探针设计是否合理。

• 检查酶活性。

1. Ct值偏高

• 模板浓度低或降解。

• 阈值设置过高。

• 体系比例需优化。

1. 曲线异常

• 封板不严或存在气泡。

• 光学通道受污染。

1. 重复性差

• 加样不均匀。

• 温度均一性异常。

十一、总结

宏石荧光定量PCR仪SLAN-48P实验流程涵盖了实验准备、样品处理、体系配置、加样、仪器设定、数据分析及维护等完整环节。通过标准化流程，实验人员能够保证实验结果的科学性和可重复性。

• 在准备阶段，应保证环境清洁与仪器状态正常。

• 在反应体系配置阶段，应严格按照配比操作，并设置必要的对照。

• 在运行阶段，应合理设定温度循环和荧光通道。

• 在数据分析阶段，应综合扩增曲线、Ct值、标准曲线与融解曲线进行判断。

• 在实验结束后，应重视仪器清洁、数据保存和系统维护。

通过对SLAN-48P实验流程的系统掌握，实验室可显著提升检测能力与科研水平，为临床诊断和科学研究提供可靠保障。