实时荧光定量PCR（qPCR）技术已经成为核酸检测的常用方法。它通过监测扩增过程中荧光信号的变化，实现核酸的定性与定量分析。宏石荧光定量PCR仪SLAN-48P作为一款中通量检测平台，广泛应用于病原体检测、基因研究、药物基因学、食品安全和环境监测等领域。
在日常实验中，除了严格按照操作规程执行，掌握一些实用技巧对于提升实验的准确性、重复性和效率尤为重要。本文将系统介绍SLAN-48P实验操作中的关键技巧，帮助实验人员更高效地开展工作。
实验室应划分为独立区域：核酸提取区、体系配置区和扩增检测区，避免交叉污染。
保持室温 18–30℃，湿度 40–70%，减少试剂性能波动。
操作前使用紫外灯或75%酒精对工作台消毒，确保环境清洁。
使用专用48孔反应板和光学透明封板膜。
吸头和离心管需无RNAse、DNAse，避免降解。
建议配备多道移液器，提高加样一致性。
样品核酸提取需采用高质量试剂盒，确保纯度与浓度达标。
纯度检测可通过A260/A280比值判断，保持在1.8–2.0之间。
低浓度样本可适当浓缩，提高检测灵敏度。
总体积建议 20–25 μL，避免过少导致蒸发或过多造成浪费。
Mg²⁺浓度需优化，过高易引发非特异性扩增，过低则反应效率不足。
引物浓度保持在 0.2–0.5 μM，探针浓度 0.1–0.25 μM 为宜。
阳性对照：验证反应体系和仪器状态。
阴性对照：检测体系是否污染。
无模板对照：避免假阳性。
内参基因：保证定量结果的可靠性。
加样过程中保持手法稳定，避免产生气泡。
样品与主混合液可先分管，再加入反应板，减少差异。
加样后使用离心机轻轻离心，使液体沉至孔底。
使用专用压膜器，保证封板紧密平整。
避免光学膜下残留气泡，否则影响荧光信号。
初始变性：95℃，2–3分钟。
循环步骤：95℃ 10秒，退火/延伸 55–65℃ 30秒，共 40–45 循环。
根据目标基因特性适当调整退火温度。
FAM、HEX、ROX、Cy5 常用于不同探针标记。
通道选择需与试剂匹配，避免串扰。
内参基因与目标基因分配至不同通道，确保结果可靠。
实验开始前检查反应板位置是否正确放置。
仪器运行中避免频繁开关仓盖。
使用软件实时监控扩增曲线，便于及时发现异常。
理想曲线应呈“S”型。
若曲线平缓或无明显上升，需检查模板或反应体系。
拖尾或平台期不明显，可能与荧光探针性能下降有关。
阈值设定应在基线期信号之上，且处于指数扩增阶段。
样品Ct值应在合理范围内，通常 15–35 之间。
重复孔Ct差异大于0.5，应排查加样误差。
标准曲线斜率在 -3.1 至 -3.6 之间，扩增效率在 90–110% 为理想状态。
R² 值大于 0.99，说明线性良好。
通过标准曲线可计算未知样本的定量结果。
单一峰值表明特异性好。
出现多峰可能存在引物二聚体或非特异产物。
融解温度（Tm值）应与理论值一致。
无扩增信号
检查模板浓度和纯度。
确认引物和探针是否有效。
核实酶是否失活。
Ct值过高
模板浓度不足。
反应体系比例不合理。
阈值设置过高。
重复性差
加样操作不一致。
板膜不严导致蒸发。
孔间温度均一性不足。
曲线异常
封板不良或有气泡。
光学模块需清洁。
试剂保存条件不当。
操作过程中佩戴手套和实验服，避免样品污染。
使用含病原体样品时需遵循生物安全规范。
废弃物需经高压灭菌或专用消毒处理后弃置。
实验后及时清理样品仓。
定期用无水乙醇擦拭外壳和光学窗口。
定期进行温控和光学系统的校准。
软件需定期升级。
实验数据应分类保存，建立备份。
建立数据溯源体系，便于质量管理。
病原体检测
利用特异性引物和探针，可快速检测病毒和细菌。
基因研究
通过ΔCt或ΔΔCt方法分析基因表达变化。
药物基因学
分析药物代谢相关基因，指导个体化用药。
食品与环境检测
检测转基因成分、食品污染或水源污染。
临床诊断
用于肿瘤相关基因检测及个体化医疗研究。
宏石荧光定量PCR仪SLAN-48P是一款结构紧凑、性能稳定的核酸检测设备。掌握实验技巧是提升实验室检测水平的重要保障。
在实验准备阶段，注重环境清洁与耗材质量；
在加样和体系优化阶段，严格控制浓度和比例；
在仪器操作阶段，合理设定程序与通道；
在数据分析阶段，结合扩增曲线、Ct值、标准曲线和融解曲线综合判断；
在实验结束后，重视维护与数据管理。
通过掌握这些技巧，操作者不仅能提高实验准确性与重复性，还能拓展SLAN-48P在科研和临床中的应用价值。
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