宏石荧光定量PCR仪SLAN-96R实验规程

一、引言

宏石荧光定量PCR仪SLAN-96R是分子诊断与核酸检测领域常用的高通量检测设备。为了保证检测结果的准确性与可重复性，实验人员必须遵循标准化规程，覆盖实验准备、仪器操作、数据分析和后期处理的全过程。本规程旨在为实验人员提供可操作的参考，确保实验质量与实验室安全。

二、实验准备

1. 实验环境

• 实验室应分为试剂准备区、样本处理区、扩增区和产物分析区，避免交叉污染。

• 环境温度保持在18–28℃，湿度适中，避免阳光直射与强电磁干扰。

• 实验台需保持清洁干燥，使用前后进行消毒。

2. 设备准备

• 确认SLAN-96R电源稳定，接地良好。

• 检查热循环模块表面是否平整清洁。

• 确保光学检测通道无灰尘或残留物。

• 打开电源，进行开机自检，确认温控与光学模块运行正常。

3. 试剂与耗材准备

• 按试剂说明书准备反应体系：缓冲液、引物、探针、dNTP、聚合酶等。

• 反应体系避免反复冻融，分装保存。

• 使用厂家推荐的反应管、反应板和透明封板膜。

• 准备无RNA/DNA酶污染的移液枪头与水。

4. 样本准备

• 通过标准化核酸提取方法获得DNA或RNA。

• 测定浓度与纯度（A260/A280比值应在1.8–2.0之间）。

• 若为RNA检测，应设置反转录步骤。

三、操作步骤

1. 反应体系配置

• 按实验方案计算各组分体积。

• 建立阳性对照、阴性对照和无模板对照。

• 混匀后分装入96孔板，避免产生气泡。

2. 装载与封板

• 使用透明封板膜均匀密封反应板，确保无液体溢出。

• 将反应板轻轻离心，排除气泡。

• 平稳放入仪器热循环模块中。

3. 程序设置

• 打开SLAN-96R配套软件，建立新实验。

• 设置反应程序：变性、退火、延伸的温度与时间。

• 根据试剂选择荧光检测模式（如SYBR Green或TaqMan探针）。

• 输入样品编号、检测项目及对照信息。

4. 启动与监控

• 点击运行，仪器开始循环扩增并实时采集荧光数据。

• 实验过程中软件显示扩增曲线，可实时监控进程。

四、数据采集与分析

1. 扩增曲线解读

• 正常曲线呈“S”型：基线期—指数期—平台期。

• 若出现异常漂移或非特异性扩增，需检查操作与试剂。

2. Ct值计算

• 仪器自动设定阈值并计算Ct值，人工需复核。

• Ct值大小反映初始模板浓度高低。

3. 定量方法

• 绝对定量：使用标准曲线法，根据Ct值推算拷贝数。

• 相对定量：使用ΔΔCt法，比较目标基因与参考基因表达水平。

4. 熔解曲线分析

• 单一峰值代表扩增特异性好。

• 多峰或峰偏移表明存在非特异性产物或引物二聚体。

五、质量控制

1. 对照设置

• 阳性对照：保证体系有效。

• 阴性对照：检测潜在污染。

• 无模板对照：检查试剂纯度。

2. 重复性

• 每批次实验均应设置技术重复。

• Ct差异大于0.5时，应考虑重复实验。

3. 记录与追溯

• 建立完整的实验记录，包括样本来源、批次号、操作人员及设备编号。

六、常见问题与解决

1. 无扩增曲线

• 检查核酸提取是否成功。

• 确认试剂是否失效。

• 确认通道设置是否正确。

2. 背景信号过高

• 试剂或耗材污染。

• 光学通道有灰尘。

3. Ct值偏高

• 模板浓度过低或降解。

• 反应体系组分不完整。

4. 多峰现象

• 引物设计不合理。

• 扩增条件需优化。

七、结果报告与存档

1. 报告内容

• 样本基本信息。

• Ct值及统计分析表格。

• 扩增曲线与熔解曲线图。

• 定量结果与结论。

2. 报告要求

• 确保格式规范，内容完整。

• 数据需经人工复核确认。

3. 数据存档

• 实验数据文件保存于指定服务器或硬盘。

• 纸质记录与电子数据对应存档，方便追溯。

八、实验安全

1. 个人防护

• 穿戴实验服、手套和护目镜。

• 避免直接接触样品与试剂。

2. 实验操作

• 样品处理区与产物分析区分开，防止污染。

• 移液器定期清洁校准。

3. 废弃物处理

• 反应后产物需高压灭菌后弃置。

• 一次性耗材分类收集，防止二次污染。

九、总结

宏石荧光定量PCR仪SLAN-96R实验规程涵盖了从实验准备到结果输出的全过程。规范化的操作能够最大限度降低误差，确保实验结果科学可靠。严格的质量控制和安全管理是保障实验室运行的关键。通过遵循该规程，实验人员不仅能充分发挥SLAN-96R的性能优势，还能为科研与临床提供准确的核酸检测数据。