宏石荧光定量PCR仪 SLAN-96R 参数设置说明

一、引言

宏石荧光定量PCR仪 SLAN-96R 具备高精度温度控制与多通道荧光检测能力，其参数设置直接影响实验的灵敏度、特异性与数据可靠性。科学合理的参数配置是确保实验成功的核心环节。本规范将从基本扩增参数到高级数据分析参数进行详细说明，结合常见应用实例，帮助实验人员掌握 SLAN-96R 的全套参数设置要点。

二、温度循环参数设置

1. 基本循环步骤

荧光定量 PCR 的核心在于热循环过程，通常分为三个阶段：

• 预变性（Initial Denaturation）

• 温度范围：94–95℃

• 时间：2–5 分钟

• 作用：完全解链模板 DNA，激活耐热 DNA 聚合酶（如使用热启动酶需更长时间）。

• 循环变性（Denaturation）

• 温度范围：94–95℃

• 时间：10–30 秒

• 作用：双链 DNA 解链。

• 退火（Annealing）

• 温度范围：50–65℃，根据引物 Tm 值设定。

• 时间：20–40 秒

• 注意：退火温度过低会导致非特异性扩增，过高则影响效率。

• 延伸（Extension）

• 温度：72℃

• 时间：30 秒至 1 分钟，根据扩增片段长度（一般 1 kb/min）。

• 荧光采集通常在此阶段进行。

• 循环次数

• 常规：35–45 个循环。

• 病原体检测：建议 40–45 次，以捕捉低拷贝数模板。

2. 热盖参数

• 热盖温度：105℃ 左右

• 功能：防止反应液蒸发，确保荧光信号稳定。

三、荧光检测参数设置

SLAN-96R 配备多通道光学系统，可支持 FAM、HEX/VIC、ROX、Cy5 等常见荧光染料。

1. 荧光采集点

• 建议在退火或延伸阶段采集荧光信号。

• 若体系采用 TaqMan 探针，宜在延伸阶段采集。

• 若采用 SYBR Green 染料，宜在退火结束或延伸阶段采集。

2. 通道选择

• 单重检测：一个荧光通道即可。

• 多重检测：合理分配不同染料至不同通道，避免光谱重叠。

3. 基线与阈值

• 基线设置：通常选择第 3–15 个循环作为基线区间。

• 阈值设置：在指数扩增区间设置阈值，避免进入平台期。

• 自动阈值：软件可自动设定，但需人工复核。

四、熔解曲线参数设置

熔解曲线分析（Melt Curve Analysis）是判断扩增产物特异性的关键步骤，尤其适用于 SYBR Green 体系。

1. 升温范围

• 一般为 65–95℃。

• 可根据产物 Tm 值适当调整。

2. 升温速率

• 建议 0.2–0.5℃/s。

• 升温过快可能导致峰型不清晰，过慢则延长实验时间。

3. 数据采集方式

• 每升高 0.2–0.5℃采集一次荧光信号。

• 生成单一熔解峰说明扩增产物特异性好；多峰提示存在非特异性或引物二聚体。

五、标准曲线与定量分析参数

定量 PCR 需借助标准曲线实现拷贝数或浓度计算。

1. 标准品设置

• 梯度稀释 5–7 个浓度点。

• 浓度范围覆盖待测样品预期 Ct 值。

2. 曲线参数

• 线性相关系数 R² ≥ 0.99。

• 扩增效率 E 在 90–110% 为合格（E = 10^(–1/slope) – 1）。

• Ct 值差异与对数浓度关系需呈线性。

3. 定量模式

• 绝对定量：通过标准曲线计算样本浓度。

• 相对定量：常用 ΔΔCt 法，以内参基因为对照。

六、软件参数与结果分析设置

SLAN-96R 配套软件提供参数设置与结果分析功能。

1. 实验类型选择

• 定性检测（病原体筛查）

• 绝对定量检测（病毒载量检测）

• 相对定量检测（基因表达差异分析）

• 熔解曲线分析（突变筛查、产物特异性验证）

2. 数据输出格式

• Ct 值表格

• 扩增曲线图

• 熔解曲线图

• 标准曲线及效率报告

3. 文件管理

• 文件命名需规范，含日期、实验类型、样品编号。

• 数据应存档并定期备份，保证可追溯性。

七、不同实验类型的参数配置实例

1. 病原体检测

• 预变性：95℃ 3 分钟

• 变性：95℃ 15 秒

• 退火/延伸：60℃ 30 秒（采集荧光）

• 循环次数：45 次

• 阴性对照必须无扩增曲线。

2. 基因表达定量

• 预变性：95℃ 2 分钟

• 变性：95℃ 15 秒

• 退火：58–60℃ 30 秒

• 延伸：72℃ 30 秒（采集荧光）

• 循环次数：40 次

• 使用 ΔΔCt 法计算相对表达量。

3. 熔解曲线分析

• 退火后：65–95℃，每 0.2℃采集一次信号

• 升温速率：0.2℃/s

• 单峰判定特异性好。

4. 多重检测

• 不同探针分配至 FAM、HEX、ROX、Cy5 等通道。

• 程序同病原体检测，但需提前验证通道无交叉干扰。

八、常见问题与参数优化

1. Ct 值过高

• 模板浓度不足，或退火温度过高。

• 可降低退火温度 1–2℃。

2. 非特异性扩增

• 调整退火温度或优化引物。

• 增加热启动步骤时间。

3. 标准曲线线性差

• 检查标准品稀释是否准确。

• 移液误差会导致 Ct 偏差。

4. 熔解曲线多峰

• 可能存在引物二聚体。

• 建议优化引物浓度与退火条件。

九、维护与保养中的参数校准

1. 温度校准

• 建议每 3–6 个月使用校准片检测温控准确性。

• 温度偏差超过 ±0.5℃需重新校准。

2. 光学校准

• 检查荧光通道灵敏度。

• 若出现信号衰减，应联系厂家进行维护。

3. 软件更新

• 定期升级软件版本，确保参数功能完善。

十、总结

宏石荧光定量PCR仪 SLAN-96R 的参数设置涵盖热循环条件、荧光检测模式、熔解曲线采集方式以及定量分析标准。只有在严格控制各项参数的前提下，才能获得高质量、可重复的实验数据。

实验人员在不同应用场景下，应根据实验目标合理配置参数：

• 临床病原体检测 强调灵敏度与阴性对照监控。

• 基因表达分析 注重内参基因选择与相对定量。

• 多重检测 需要精确分配荧光通道。

• 熔解曲线分析 要求精细的升温速率。

通过掌握这些参数设置规范，SLAN-96R 可以在科研、临床、农业与食品安全等多领域发挥最大价值，为实验人员提供可靠的数据支持。