宏石荧光定量PCR仪SLAN-96R实验原理

一、引言

核酸检测是现代分子生物学与临床诊断的重要技术基础，其中实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR, qPCR）因其灵敏度高、特异性强、定量准确的特点，已成为基因检测、病原体识别、转录水平分析和药物研发中的核心方法。宏石SLAN-96R是一款代表性设备，其实验原理既承袭了PCR技术的经典机制，又融合了实时荧光检测和计算机数据分析手段，实现了核酸扩增的定量化。

二、聚合酶链式反应（PCR）基本原理

1. DNA扩增循环

PCR通过温度循环控制DNA双链变性、引物退火及DNA聚合延伸三个步骤，使目标序列在短时间内实现指数级扩增。

• 变性阶段（Denaturation）：在高温下（一般94–95℃），双链DNA解开为单链。

• 退火阶段（Annealing）：在适中温度下（50–65℃），引物与目标序列互补结合。

• 延伸阶段（Extension）：在DNA聚合酶作用下，dNTP按碱基互补原则逐步延伸，合成新的DNA链。

一个循环结束，目标序列数量翻倍。经过30–40个循环，可将极少量DNA扩增至检测水平。

2. PCR扩增的指数性

PCR扩增理论上呈指数增长：n个循环后，目标序列数为2^n倍。但在实际中，因酶活性下降、底物耗尽及副反应影响，后期增长趋于平台化。

三、实时荧光定量PCR原理

1. 实时监测与定量的思路

传统PCR需要扩增结束后通过电泳检测，而实时荧光定量PCR在反应过程中直接监测产物累积，记录荧光信号随循环数的变化，从而得到扩增曲线。

2. 荧光信号与扩增产物的关系

荧光染料或探针与扩增产物结合，荧光强度与产物量成正比。通过监测荧光强度的变化，可以实现以下功能：

• 判断目标序列是否存在（定性）。

• 比较不同样品核酸浓度差异（相对定量）。

• 根据标准曲线计算绝对拷贝数（绝对定量）。

3. 常见荧光检测体系

• SYBR Green体系：结合双链DNA时发出强荧光，简单经济，但可能受非特异性产物干扰。

• TaqMan探针体系：依赖荧光基团与淬灭基团的解离实现特异性检测，准确性高。

• 分子信标与FRET探针：通过能量转移实现信号监测，用于多重检测。

四、SLAN-96R实验原理

1. 温控系统原理

SLAN-96R采用高精度半导体控温技术（Peltier效应），通过电流方向切换实现快速加热与降温。

• 热循环模块：保证96孔板每个孔位温度均匀。

• 温控精度：误差可控制在±0.1℃，确保扩增的可重复性。

• 梯度温控功能：允许一次实验中设定多个退火温度，用于引物优化。

2. 光学检测系统原理

该仪器内置高强度光源、滤光片和高灵敏度光电探测器：

• 激发光源：发出特定波长光，激发荧光染料。

• 滤光系统：分离不同波长的光，避免通道间干扰。

• 光电探测器：接收荧光信号并转化为电信号。

多通道设计允许同时监测不同的荧光染料，实现多重检测。

3. 数据采集与分析原理

• 扩增曲线：记录每一循环的荧光强度变化。

• 阈值设定：软件设定阈值线，确定Ct值（Cycle threshold）。

• 定量计算：通过标准曲线或ΔΔCt方法，计算样品核酸浓度。

五、Ct值与定量原理

1. Ct值定义

Ct值是扩增曲线荧光信号超过阈值时对应的循环数。Ct值与初始模板浓度成反比，浓度越高Ct值越小。

2. 绝对定量

• 制备已知浓度标准品，建立Ct值与拷贝数关系曲线。

• 样品Ct值代入标准曲线方程，即可求得其浓度。

3. 相对定量

• 通过目标基因与内参基因的Ct差异，比较不同样品的表达水平。

• ΔΔCt法是常用计算方式。

六、熔解曲线分析原理

1. 基本机制

扩增结束后逐步升温，使PCR产物双链解链。随着温度升高，荧光染料逐渐释放，信号下降，形成熔解曲线。

2. 应用

• 判断扩增产物特异性：单一峰值表示特异扩增。

• 区分基因型或突变：不同产物有不同熔解温度（Tm）。

七、信号处理与结果输出

1. 背景扣除

仪器在初始循环记录背景信号，并在分析中扣除，以提高灵敏度。

2. 曲线拟合

利用数学模型对扩增曲线进行拟合，保证Ct值计算准确。

3. 报告生成

系统自动输出Ct值表格、扩增曲线、熔解曲线及定量分析结果，支持PDF或Excel导出。

八、SLAN-96R实验优势与应用

1. 技术优势

• 高通量：一次可检测96个样本。

• 多通道：支持多重荧光检测。

• 灵敏度高：低至几个拷贝的模板也可检测。

• 软件智能化：自动完成曲线分析与结果输出。

2. 应用领域

• 临床医学：病原体检测、基因突变筛查。

• 科研实验：基因表达研究、分子克隆验证。

• 食品安全：转基因成分检测。

• 环境监测：微生物污染监控。

九、注意事项

1. 样品处理需避免RNA/DNA降解。

2. 实验分区严格，避免扩增产物污染。

3. 内参基因必须稳定，确保定量准确性。

4. 使用推荐的反应管和封板膜，保证光学检测无误差。

十、总结

宏石荧光定量PCR仪SLAN-96R的实验原理融合了PCR扩增循环、实时荧光检测与计算机数据分析三大核心技术。其工作流程包括温控系统实现核酸扩增、光学系统捕捉荧光信号、软件算法进行数据转化。通过Ct值和熔解曲线，用户能够获得准确、可靠的定性与定量信息。SLAN-96R不仅保证了实验的高灵敏度和高通量，还为科研与临床检测提供了稳定的数据支撑。