赛默飞荧光分光光度计操作流程详解
荧光分光光度计是一种高灵敏度的分析仪器，广泛用于生物、医药、化学、材料等领域中对样品中荧光物质进行定性和定量分析。赛默飞Thermo Scientific作为全球领先的科学仪器品牌，其荧光分光光度计以性能稳定、操作简便、灵敏度高等优势受到科研人员广泛欢迎。以下将以通用型号为例，系统介绍其操作流程。
一、仪器组成与基本原理
荧光分光光度计主要由以下部分组成：
激发光源：通常为氙灯或汞灯，用于提供激发样品的光。
激发单色器：选择所需激发波长，通常为棱镜或光栅结构。
样品室：放置样品的区域，配有温控系统和样品支架。
发射单色器：用于选择样品发射的特定荧光波长。
检测器：常用光电倍增管（PMT），用于检测荧光强度并转换成电信号。
数据处理系统：集成在主机或外接计算机中，实现数据的采集、分析与保存。
荧光分光光度计的基本原理是：样品在吸收特定波长的激发光后，其分子被激发至高能级，随后返回基态时释放能量，以较长波长的荧光形式发出。检测这些发射光信号，即可实现对样品中荧光物质的分析。
二、仪器启动与准备
开机顺序
打开主机电源开关。
启动控制软件（通常预装在电脑上，如Thermo INSIGHT软件）。
等待光源稳定，建议预热30分钟，以确保激发光输出稳定。
校准与初始化
进行波长校准和灵敏度校准，校准过程中可使用标准荧光样品或空白溶液。
检查光源寿命记录，避免因光源老化影响测量准确性。
初始化系统设置，包括通道选择、扫描方式、增益设置等。
准备样品
使用荧光纯净水或缓冲液配制待测溶液，样品应清澈、无悬浮颗粒。
样品浓度应在荧光线性范围内，以免出现猝灭效应或饱和问题。
使用石英比色皿（通常为1 cm光程），保持清洁无划痕。
三、操作流程详解
（一）激发和发射波长设定
打开软件界面，进入测量模式；
设置激发波长（Ex）与发射波长（Em）：
若已知荧光物质最大激发与发射波长，直接输入数值；
若未知，可先进行激发扫描或发射扫描，确定最佳波长组合。
（二）扫描参数设置
常见的扫描类型有三种：
激发光谱扫描：固定发射波长，扫描激发波段，常用于确定最大激发波长；
发射光谱扫描：固定激发波长，扫描发射波段，获取荧光峰信息；
同步扫描：激发与发射波长同步变化，适用于复杂混合样的分离检测。
扫描参数包括：
扫描范围（如250–600 nm）
步进间隔（通常为1 nm）
穿透时间（如0.1–1 s）
光带宽（1–10 nm，根据样品特性选择）
增益（自动或手动设定）
（三）样品测量
插入空白比色皿进行背景扣除；
插入待测样品比色皿；
开始扫描或采集数据；
查看实时荧光强度曲线，检查是否有异常（如突变峰值、漂移等）；
可重复测量多次，计算平均值提高准确性。
（四）数据处理与保存
峰值分析：系统会自动识别荧光峰并给出峰位与强度；
定量分析：可建立标准曲线，采用线性拟合或多项式拟合方法；
数据导出：支持导出为TXT、Excel、图像格式等，便于后续统计与汇报；
结果校验：对照标准样或文献数据，验证测量结果是否合理。
四、日常维护与注意事项
（一）光源维护
定期查看光源累计使用时间，按规定及时更换；
灯泡更换后应重新进行波长与强度校准；
避免频繁开关，延长光源寿命。
（二）样品池清洁
使用去离子水和乙醇冲洗比色皿，保持光学面清洁；
不使用碱性或有腐蚀性的清洁剂；
清洁后用镜头纸轻轻擦干，避免划伤。
（三）软件与系统维护
软件定期升级，确保兼容性与功能完整；
数据定期备份，避免意外丢失；
校准数据、历史记录应妥善保存，供质量控制使用。
（四）操作安全与注意事项
在测量过程中避免直视激发光路径，防止眼部伤害；
注意实验室通风，避免荧光试剂挥发引起中毒；
使用标准操作规程，确保实验重复性与可追溯性。
五、常见问题及解决方案
| 问题 | 可能原因 | 解决方法 |
|---|---|---|
| 无信号或信号弱 | 样品浓度低、激发波长设定不当 | 更换样品浓度、重新扫描波长 |
| 光谱出现多重峰值 | 杂质干扰、比色皿污染 | 更换比色皿、使用高纯度试剂 |
| 信号不稳定 | 光源未预热足够、样品沉降 | 延长预热时间、搅拌或重新分散样品 |
| 软件无法识别设备 | 通讯接口故障、驱动未安装 | 检查连接线、重新安装驱动程序 |
| 光谱偏移 | 校准失效 | 重新进行波长与灵敏度校准 |
六、扩展功能与应用示例
荧光定量PCR：结合特定染料对核酸片段进行实时检测；
环境分析：测定水样中多环芳烃、重金属配合物等；
药物检测：评估药物代谢产物的荧光特性；
蛋白质分析：利用本征或标记荧光探针进行定量；
纳米材料研究：观察量子点、荧光纳米粒子的发光行为。
七、总结
赛默飞荧光分光光度计具备高灵敏度、操作便捷和应用广泛等特点，适用于多种荧光分析需求。科学、规范的操作流程是确保数据可靠性的前提。通过合理设定参数、妥善处理样品、加强日常维护，可大幅提升仪器的使用效率与实验成功率。使用过程中应严格遵循实验室操作规程，确保仪器性能稳定和使用者安全。
