什么是实时荧光定量PCR仪？

实时荧光定量PCR仪（Real-Time Quantitative PCR，简称qPCR）是一种用于检测和定量核酸（DNA或RNA）样品的高精度实验仪器。它结合了聚合酶链式反应（PCR）和荧光检测技术，在DNA扩增的过程中实时监测荧光信号变化，从而实现核酸的定量分析。

一、工作原理

1. PCR扩增
   实时荧光定量PCR基于传统PCR技术，分为三个主要步骤：

   通过多次循环，目标核酸逐步扩增。

• 变性（94-95°C）：将双链DNA分离成单链。

• 退火（50-65°C）：引物与目标DNA模板结合。

• 延伸（72°C）：DNA聚合酶合成新链。

2. 荧光检测

• 荧光标记：在PCR反应体系中加入荧光染料（如SYBR Green）或特异性荧光探针（如TaqMan探针）。

• 荧光信号采集：荧光强度与扩增的DNA数量成正比，仪器实时采集荧光信号并记录。

3. 定量分析

• 通过计算荧光信号与循环数的关系（Ct值），与标准曲线对比，得出目标核酸的初始浓度，实现绝对定量或相对定量。

二、实时荧光定量PCR仪的特点

1. 实时监控

• 仪器实时监测核酸扩增过程中荧光信号的变化，生成扩增曲线。

2. 高灵敏度和高特异性

• 能够检测微量核酸，灵敏度可达到pg级别。

• 使用特异性探针时，避免非特异性扩增干扰。

3. 定量分析能力

• 提供准确的绝对定量和相对定量结果。

4. 快速高效

• 实验时间通常为30分钟到2小时，适合高通量检测。

5. 多通道检测

• 支持多个荧光通道，可同时检测多个目标核酸。

三、实时荧光定量PCR仪的主要组成部分

1. 热循环模块

• 控制温度循环的核心部分，精确执行变性、退火和延伸等步骤。

2. 荧光检测模块

• 包括光源（如LED或氙灯）和光电探测器，用于激发和检测荧光信号。

3. 样品反应模块

• 配备适配微孔板、毛细管或反应管的样品槽，用于容纳PCR反应体系。

4. 数据分析系统

• 集成软件实时记录荧光信号，生成扩增曲线并进行数据分析。

5. 用户界面

• 通过电脑软件或触摸屏操作界面，设置实验参数和查看实验结果。

四、实时荧光定量PCR仪的应用

1. 医学诊断

• 病原体检测：快速检测病毒（如新冠病毒）、细菌感染。

• 遗传病筛查：检测基因突变、拷贝数变异（CNV）。

• 肿瘤标志物分析：定量检测肿瘤相关基因。

2. 基因表达研究

• mRNA定量：通过逆转录反应，定量分析基因表达水平。

• 非编码RNA研究：分析miRNA或其他RNA分子的表达。

3. 药物开发

• 基因靶点验证：评估药物对目标基因的调控作用。

• 药物代谢研究：分析药物代谢相关基因的表达变化。

4. 农业与食品科学

• 转基因检测：确认转基因生物或食品中目标基因的存在。

• 病原微生物检测：诊断植物病害或食品污染。

5. 环境监测

• 定量检测环境样品中的微生物，如水体中致病菌的监测。

五、检测方法

1. SYBR Green染料法

• 荧光染料与双链DNA结合，扩增过程中荧光强度增加。

• 优点：成本低，操作简单。

• 缺点：可能存在非特异性扩增。

2. 探针法

• 使用特异性荧光探针（如TaqMan探针），扩增过程中探针被降解释放荧光。

• 优点：高特异性，适合多通道检测。

• 缺点：设计复杂，成本较高。

3. 熔解曲线分析

• 检测扩增完成后双链DNA的解链温度，验证扩增特异性。

• 常用于染料法实验的结果验证。

六、实验操作步骤

1. 样品准备

• 提取目标核酸（DNA或RNA），确保纯度和浓度符合实验要求。

2. 配制反应体系

• 混合引物、探针（或荧光染料）、酶、缓冲液和模板核酸。

3. 反应设置

• 将反应混合液分装至微孔板或反应管中。

• 设置PCR程序（如变性95°C，退火60°C，延伸72°C）。

4. 运行实验

• 将样品模块置于仪器中，启动程序并实时记录荧光信号。

5. 数据分析

• 使用软件生成扩增曲线，分析Ct值，计算目标核酸浓度。

七、常见品牌与型号

1. 进口品牌

• LightCycler系列，适合高精度分析。

• CFX96，灵敏度高，支持多通道检测。

• QuantStudio系列，功能全面，适用于科研和临床。

• Applied Biosystems (ABI)

• Bio-Rad

• Roche

2. 国产品牌

• 集成多功能，支持科研和工业应用。

• 高性价比，适合中小型实验室。

• 天根生物

• 博奥生物

八、实时荧光定量PCR仪的优缺点

优点

1. 高灵敏度：可检测微量核酸，适用于低拷贝样品。

2. 高特异性：特别是探针法，避免非特异性扩增干扰。

3. 实时监测：全程可视化，避免后续处理。

4. 多通道检测：支持多个靶标的同时分析。

缺点

1. 成本较高：设备和试剂价格昂贵。

2. 操作技术要求高：需要严格的实验设计和样品准备。

3. 易污染：对实验环境和操作规范要求严格。

九、实时荧光定量PCR仪的未来发展趋势

1. 便携化

• 开发便携式设备，适应现场检测和紧急诊断需求。

2. 智能化

• 引入人工智能和自动化技术，提高数据分析效率。

3. 多功能集成

• 实现核酸提取、扩增、检测一体化，简化实验流程。

4. 低成本化

• 开发经济型设备和试剂，推广至更广泛的领域。

十、总结

实时荧光定量PCR仪是一种结合PCR技术和荧光检测的高精度仪器，能够快速、准确地检测和定量核酸。它广泛应用于医学诊断、基因研究、药物开发等领域，为科学研究和临床实践提供了重要支持。随着技术的不断发展，实时荧光定量PCR仪将更加便携、智能和经济，为分子诊断和精准医学的发展开辟更广阔的前景。