蛋白纯化 | 四大蛋白表达系统全解析
蛋白表达系统是指通过特定的宿主细胞表达外源蛋白的技术平台，用于研究蛋白功能、结构以及生产蛋白药物等。不同的蛋白表达系统适用于不同类型的蛋白质，并且在表达效率、后期加工（如翻译后修饰）、纯化难易程度和成本等方面各有特点。以下是四大常见蛋白表达系统的解析。
一、原核表达系统
1. 系统特点
宿主：常用大肠杆菌（Escherichia coli）。
优点：
表达效率高，生产周期短。
适合大规模生产，成本低。
适合表达简单结构的蛋白，如无复杂修饰的酶类。
缺点：
蛋白质可能以包涵体形式表达，需要变性和复性处理。
缺乏翻译后修饰（如糖基化、磷酸化）。
难以表达分泌型或跨膜蛋白。
2. 应用范围
表达简单的重组蛋白。
工业酶生产（如脂肪酶、纤维素酶）。
基础研究中的蛋白功能研究。
3. 常用表达载体
pET系列载体：高效启动子（如T7启动子），适合高表达需求。
pGEX系列载体：融合GST标签，方便后续纯化。
4. 表达与纯化流程
构建重组质粒并转化大肠杆菌。
诱导蛋白表达（如用IPTG）。
细胞裂解，提取蛋白。
使用亲和层析柱（如Ni²⁺柱）纯化蛋白。
二、酵母表达系统
1. 系统特点
宿主：常用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、毕赤酵母（Pichia pastoris）。
优点：
表达效率高，易于实现分泌型表达。
可进行部分翻译后修饰（如糖基化）。
培养成本低，适合中规模生产。
缺点：
糖基化模式不同于哺乳动物细胞。
复杂蛋白表达能力有限。
2. 应用范围
表达分泌型蛋白、抗体片段或酶类。
工业生产中应用的功能性蛋白。
3. 常用表达载体
pPIC系列载体：适合毕赤酵母，包含强启动子（如AOX1）。
pYES系列载体：适合酿酒酵母。
4. 表达与纯化流程
构建表达质粒并转化酵母。
在甲醇诱导条件下表达目标蛋白。
收集培养上清（用于分泌型表达）。
通过亲和层析或离子交换层析纯化。
三、昆虫细胞表达系统
1. 系统特点
宿主：昆虫细胞（如Sf9、Sf21）与杆状病毒表达系统。
优点：
能进行复杂的翻译后修饰（如糖基化、磷酸化）。
蛋白折叠正确，生物活性高。
适合表达高分子量或复杂结构蛋白。
缺点：
生产周期较长。
成本高于原核和酵母系统。
2. 应用范围
表达疫苗抗原（如病毒样颗粒）。
表达酶类、受体和其他复杂功能性蛋白。
3. 常用表达载体
pFastBac载体：用于杆状病毒系统的蛋白表达。
pIB系列载体：适合昆虫细胞表达。
4. 表达与纯化流程
构建杆状病毒载体并感染昆虫细胞。
收集培养上清或细胞裂解液。
通过亲和层析、凝胶过滤或离子交换层析纯化。
四、哺乳动物细胞表达系统
1. 系统特点
宿主：常用CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）、HEK293细胞。
优点：
翻译后修饰与天然蛋白一致。
可表达分泌型蛋白、跨膜蛋白和抗体。
适合生产具有生物活性的治疗性蛋白。
缺点：
成本高，培养条件要求严格。
表达效率低于原核和酵母系统。
2. 应用范围
生物药物生产（如单克隆抗体、细胞因子）。
高质量蛋白的结构和功能研究。
3. 常用表达载体
pCDNA3系列载体：强启动子（如CMV启动子）驱动高效表达。
pTT系列载体：用于瞬时表达。
4. 表达与纯化流程
构建表达质粒并转染哺乳动物细胞。
收集培养上清或细胞裂解液。
通过亲和层析（如Protein A柱）、离子交换层析纯化。
五、四大系统对比总结
| 属性 | 原核系统 | 酵母系统 | 昆虫细胞系统 | 哺乳动物系统 |
|---|---|---|---|---|
| 表达效率 | 高 | 高 | 中等 | 较低 |
| 生产成本 | 低 | 低 | 中等 | 高 |
| 翻译后修饰 | 无 | 部分 | 接近天然 | 接近天然 |
| 适合蛋白类型 | 简单蛋白、酶 | 分泌型蛋白、小型多肽 | 复杂功能性蛋白 | 分泌型蛋白、抗体、药物蛋白 |
| 典型应用 | 工业酶、基础研究 | 抗体片段、工业蛋白 | 疫苗、复杂酶 | 生物药物、结构功能研究 |
六、蛋白质纯化方法概览
不同表达系统中产生的目标蛋白需要根据其特性设计相应的纯化流程。以下是常用的蛋白质纯化方法：
1. 亲和层析
原理：利用目标蛋白与特定配体的结合。
应用：如His标签蛋白用Ni²⁺柱，抗体用Protein A柱。
2. 离子交换层析
原理：根据蛋白质电荷差异分离。
应用：去除电荷相近的杂质。
3. 凝胶过滤层析
原理：按分子量分离。
应用：去除聚合体或降解产物。
4. 疏水作用层析
原理：按疏水性分离。
应用：分离疏水性较强的蛋白。
5. 超滤和透析
原理：通过分子量截留去除小分子杂质。
应用：缓冲液更换和浓缩。
七、如何选择合适的蛋白表达系统
目标蛋白特性：
简单蛋白优先选择原核系统。
分泌型或复杂蛋白优选酵母或哺乳动物系统。
实验规模与成本：
小规模实验可选择低成本的原核或酵母系统。
商业化生产需选择昆虫或哺乳动物系统。
翻译后修饰需求：
需要糖基化等修饰的蛋白建议选择昆虫或哺乳动物系统。
总结
四大蛋白表达系统各具特点，适用不同的研究和生产需求。在实际应用中，应根据目标蛋白的特性、表达需求和成本预算选择合适的系统，同时设计科学合理的纯化流程，确保目标蛋白的高纯度和高活性。
